如何准确测定细菌总数？

1.检验程序

菌落总数的检验程序如图2-2-1所示。

2.样品的稀释

1）固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，以8000～10000r/min转速均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。

2）液体样品：用无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

图2-2-1 菌落总数的检验程序

3）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注入盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

4）按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

5）根据对样品污染状况的估计，选择2个或3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液置于无菌平面皿内，每个稀释度做两个平面皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平面皿内作空白对照。

6）及时将15～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平面皿，并转动平面皿使其混合均匀。

3.培养

待琼脂凝固后，将平板翻转，于36℃±1℃培养48h±2h，（水产品于30℃±1℃培养72h±3h）。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落，则可在凝固后的琼脂表面覆盖薄薄的一层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，进行培养。

4.菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位CFU表示。

选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，选菌落数低于30CFU的平板记录具体菌落数，菌落数大于300CFU的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。若片状菌落数不到平板总菌落数的1/2，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可在计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

当平板上的菌落间出现无明显界线的链状生长现象时，应将每条单链作为一个菌落计数。

5.结果与报告

（1）菌落总数的计算方法(www.xing528.com)

1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为每克（毫升）样品中的菌落总数。

2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，则按式（2-2-1）计算。

N=ΣC（n₁+0.1n₂）d （2-2-1）

式中 N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n₁——第一次稀释度（低稀释倍数）的平板个数；

n₂——第二次稀释度（低稀释倍数）的平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

4）若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5）若所有稀释度（包括液体样品原液）的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

6）若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300CFU之间，且其中一部分小于30CFU或大于300CFU，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

（2）菌落总数的报告

1）当菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”的原则修约，以整数报告。

2）当菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”的原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”的原则修约后，采用两位有效数字。

3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

5）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。