（一）概述
细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异氧菌密度的方法。因为细菌能以单独个体、成双成对、链状、成簇等形式存在，而且没有任何单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以，由此法所得的菌落可能要低于真正存在的活细菌的总数。
此法主要作为判定饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。
（二）实验目的
（1）了解和学习水中细菌总数的测定原理和测定意义。
（2）学习和掌握用稀释平板记数法测定水中细菌总数的方法。
（三）实验原理
水是微生物广泛分布的天然环境。水中的微生物主要来源有水中的水生微生物（如光合藻类），来自土壤径流、降雨的外来菌群，来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
细菌菌落总数（CFU）是指1mL水样在牛肉膏琼脂培养基中，于37℃培养24h后所生长的腐生性细菌菌落总数。它是有机物污染程度的指标，也是卫生指标。《生活饮用水卫生标准》（GB5749—2006）规定：细菌菌落总数在1mL自来水中不得超过100个。
（四）仪器器材
（五）实验内容与操作方法
1.自来水
（1）采集自来水水样 先将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌，再开放水龙头，流水5min后，用无菌的三角瓶取水样，如果水样含有余氯，则采样瓶灭菌后，按每500mL水样加3%的Na2S2O3·5H2O溶液1mL。
（2）以无菌操作方法，用无菌移液管吸取1mL水样注入无菌培养皿中，倾注15～20mL已熔化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，平放于桌上迅速摇匀，使水样与培养基充分混匀，凝固后倒置于37℃培养箱中，培养24h，然后进行菌落计数。每个水样倒三个平板，另取一个做空白对照，三个平板的平均菌落数即为1mL水样的细菌菌落总数。
2.水源水（江、河、湖、池等地表水体）
（1）水体取样 可以采用采样器或带塞的玻璃瓶取样。采样器或带塞的玻璃瓶提前灭菌，将带塞的玻璃瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拿掉瓶塞，瓶口逆着水流方向取水，水量不要过满，水面到瓶口留有2～3cm的空隙，盖上瓶盖，再将玻璃瓶从水中取出。
（2）稀释水样 在无菌条件下，将水样做10倍系列稀释（图1-16）。
（3）根据对水样污染情况的估计，选择2～3个适宜的稀释度，以培养后平板的菌落数在30～300个的稀释度为合适。吸取1mL稀释液于无菌平皿内，每个稀释度做3个重复。(www.xing528.com)
图1-16
（4）以无菌操作方法，用无菌移液管吸取1mL水样注入无菌培养皿中，倾注15～20mL已熔化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，平放于桌上迅速摇匀，使水样与培养基充分混匀。
（5）培养基凝固后，倒置于37℃培养箱培养24h，计菌落数，算出三个平板的平均菌落数，再乘以稀释倍数即为1mL水样的细菌菌落总数。
（六）菌落计数及报告方法
用肉眼观察，计数平板上的细菌菌落数，也可用放大镜和菌落计数器计数。记下同一浓度的三个平板的菌落总数，计算平均值，再乘以稀释倍数即1mL水样中的细菌菌落总数。各种不同情况的计算方法如下：
（1）首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告（表1-7例次1）。
（2）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300，则按两者菌落总数之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较小的菌落总数（表1-7例次2及例次3）。
（3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告（表1-7例次4）。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告（表1-7例次5）。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告（表1-7例次6）。
（6）在求同稀释度的平均数时，若其中一个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落数分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。
（7）菌落计数的报告，菌落数在100以内时核实有效报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的位数，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，可用10的指数来表示（表1-7报告方式栏）。若报告菌落数“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。细菌菌落测定结果记录于表1-8和表1-9中。
表1-7 计数菌落总数方法举例
表1-8 自来水中细菌菌落数测定结果
表1-9 水源水中细菌菌落测定结果
（七）思考题
（1）根据我国饮用水水质标准，讨论这次检验结果。
（2）测定水体中细菌菌落总数有什么意义？
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