重组DNA技术中的基本工具酶及其重要性

在重组DNA技术中，常需要一些基本工具酶进行基因操作。如对目的基因进行处理时，需利用序列特异的限制性核酸内切酶在准确的位置切割DNA，使较大的DNA分子成为一定大小的DNA片段；构建重组DNA分子时，必须在DNA连接酶催化下才能使DNA片段与克隆载体共价连接。此外，还有一些工具酶也都是重组DNA时必不可少的。

（一）限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶是基因工程必需的工具酶，具有特别的重要意义。所谓限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。目前已知的限制性核酸内切酶有1 800余种，主要是从细菌中提取的。限制性核酸内切酶具有高度专一性，能识别的核苷酸序列通常是4～8个碱基对。限制性核酸内切酶的切口有两种类型。一种为黏性末端，即两链的切口错开2～4个碱基。因为两个末端的碱基互补配对，易于配合。常见的有5′末端突出的黏性末端和3′末端突出的黏性末端。另一种为平头末端，即在同一水平上切断DNA的双链。同一种限制性内切酶所产生的黏性末端是相同的，相同的黏性末端的碱基具有互补性，通过连接酶可把它们连接起来，因而，具有黏性末端的DNA片段容易结合进载体DNA分子中，表24-1中列举了几种最常用的限制性核酸内切酶。

表24-1　限制酶识别序列和切割方式举例

续表

注：↓表示切割位点(www.xing528.com)

（二）其他工具酶

1.DNA聚合酶　这类酶需DNA模板，也需要引物，催化5′→3′核苷酸链的延长。常用的有大肠埃希菌聚合酶I和耐热DNA聚合酶。耐热DNA聚合酶是一类从水栖耐高温菌中分离到的DNA聚合酶，具有5′→3′聚合酶活性，催化DNA合成的活性可适应相当宽的温度范围。在95℃的半衰期为35min，对聚合酶链反应（PCR）技术的发展起关键作用。

2.DNA连接酶　DNA连接酶可催化一个DNA链的5′-P末端与另一个DNA链的3′-OH末端通过磷酸二酯键而连接起来。它可催化平头末端或黏性末端的DNA链之间的连接，但连接平头末端的效率远低于后者。

3.其他　如反转录酶、多聚核苷酸激酶、碱性磷酸酶等。