水中大肠菌群MPN法检测结果

一、实验目的

（1）掌握多管发酵法检测水中大肠菌群的方法。

（2）了解大肠菌群数量在饮用水中的意义及其生化特性。

二、基本原理

水中致病菌的数量较少，检测难度很大。大肠菌群是人和动物体内的正常菌群，在水中的数量与致病菌的数量呈正相关，而且大肠菌群的数量比较多，比较容易检测，所以，通常用大肠菌群的数量作为水的细菌学卫生标准。大肠菌群是一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌，在乳糖培养基中于37℃培养24～48 h能产酸产气（很多其他的细菌无此现象）。据水中大肠菌群的数量可以判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。在乳糖培养基中倒置一支德汉氏小套管收集产生的气体。在培养基内加溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。据此来鉴别水中的大肠菌群，再结合一定的技术手段，借助专门的统计表，就能得到水中的大肠菌群数量。

我国规定每升生活饮用水中大肠菌群数不能超过3个；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均1 mL不得超过1 000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均1 mL不得超过10 000个。

总大肠菌群的检测方法主要有多管发酵法（MPN法）和滤膜法。多管发酵法被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种到乳糖发酵管，据发酵反应的结果，确定大肠菌群的阳性管数后，在检索表中查出大肠菌群的近似值。该法较复杂。多管发酵法适用于饮用水、水源水，尤其是混浊度高的水中总大肠菌群的测定。滤膜法是一种快速的替代方法，能测定大体积的水样，但只局限于饮用水或较洁净的水。目前，在一些大城市的水厂常采用滤膜法。本实验用多管发酵法检测水中大肠菌群。

多管发酵法检测大肠菌群的数量一般分为3步：初发酵试验，平板分离，复发酵试验。

1.初发酵试验

将水样接种于发酵管内，37℃下培养，24 h内小套管中有气泡生成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，结果阳性。但也有产酸不产气和48 h后才产气的现象，这就需要做平板分离和复发酵试验，才能确定是否属大肠菌群。

2.平板分离

经24 h培养后，将产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红-亚甲蓝琼脂平板上，在于37℃培养箱内培养18～24 h。将符合下列特征的菌落的一部分，进行涂片、革兰氏染色、镜检：深紫黑色，有金属光泽；紫黑（绿）色、不带或略带金属光泽；淡紫红色、中心颜色较深；紫红色。

3.复发酵试验

经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖胆盐发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个，37℃培养24 h。结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。根据初步发酵的大肠菌群存在的发酵管数，查阅专门的统计表，得到大肠菌群数量。

三、实验器材

1.试剂

（1）蛋白胨，牛肉膏，乳糖，氯化钠，质量浓度为16 g/L的溴甲酚乙醇溶液，蒸馏水，磷酸氢二钾，琼脂，无水亚硫酸钠，质量浓度为50 g/L碱性品红乙醇溶液，质量浓度为20 g/L的伊红水溶液及质量浓度为5 g/L的亚甲蓝水溶液，质量浓度为100 g/L的氢氧化钠溶液、体积分数为10%的盐酸（原液为36%），精密pH试纸（6.4～8.4），质量浓度为15 g/L的硫代硫酸钠溶液，灭菌水等。

（2）自来水（或受粪便污染的河、湖水）：400 mL。

2.染色剂

革兰氏染色液：草酸铵结晶紫，革兰氏碘液，体积分数为95%的乙醇、番红染液。

3.仪器及其他用具

高压蒸汽灭菌器，恒温培养箱，显微镜，锥形瓶（500 mL）1个，试管（18 mm×180 mm）6～7支，移液管1 mL的2支和10 mL的1支，带玻璃瓶塞，培养皿10套，接种环1个，试管架1个，吸管，乳糖胆盐发酵管，三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小倒管）等。

四、实验准备

（一）培养基配制

1.乳糖蛋白胨培养基（初发酵、复发酵使用）

蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，乳糖5 g，氯化钠5 g，质量浓度为16 g/L的溴甲酚乙醇溶液1 mL，蒸馏水1 000 mL，pH为7.2～7.4。为了抑制革兰氏阳性菌生长，促进革兰氏阴性菌生长，配制时往往加入胆盐（3 g/L）。

分别称量上述各组分，加热溶解于1 000 mL蒸馏水，pH调至7.2～7.4；加入溴甲酚紫乙醇溶液1 mL，混匀；每管10 mL分装于试管中；取一小倒管倒放入试管内；管口塞上棉塞，包装，置于高压灭菌器115℃、压力0.072 MPa灭菌20 min；取出放于阴凉处备用。

2.三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（供初发酵用）

按上述乳糖蛋白胨培养基的配方，浓缩3倍配制，每试管装5 mL（初发酵时加入10 mL水样）；也可配制双料乳糖蛋白胨培养液，每试管装10 mL（初发酵时加入10 mL水样）。在每管内倒放一个小倒管，管口塞好棉塞，包装，灭菌（115℃、0.072 MPa）20 min。

为节省时间，也可购买商品乳糖蛋白胨脱水培养基，较方便。

3.伊红-亚甲蓝培养基（供平板划线用）

（1）组分：蛋白胨10 g，乳糖10 g，磷酸氢二钾2 g，琼脂20～30 g，蒸馏水1 000 mL，质量浓度为20 g/L的伊红水溶液20 mL，质量浓度为5 g/L的亚甲蓝水溶液13 mL。(www.xing528.com)

（2）配制：将蛋白胨、磷酸氢二钾、琼脂按上述份额称量、溶解于1 000 mL蒸馏水，调整pH为7.2，加入乳糖，溶解、混匀、分装，在0.072 MPa、115℃条件下用高压灭菌器灭菌，待用。使用前加热融化培养基，冷却至50℃～55℃时，加入伊红和亚甲蓝水溶液，混匀，倒平板。

目前，伊红-亚甲蓝培养基在市面上也有销售，使用方便。

（二）水样收集

1.自来水采集

自来水采集时先将水龙头用火焰烧灼3 min，放水5 min，以无菌三角烧瓶接取水样。

若经氯处理的水中含有余氯，会减少水中细菌数量，采样瓶在灭菌前需加入硫代硫酸钠，以消除余氯。硫代硫酸钠的用量据采样瓶容量而定。若容量瓶500 mL，加入质量浓度为15 g/L的硫代硫酸钠溶液1.5 mL，可消除质量浓度为2 mg/L的450 mL水样中的全部氯量。

2.湖、河、井水、海水的采集

将灭菌的带玻璃塞瓶的瓶口向下浸入池水、井水、海水、河水或湖水中距水面10～15 cm的深层，然后翻转过来，除去玻璃塞。盛满水后，将瓶塞塞好，再从水中取出。水样须立即进行检测。

图2-4　采样器

也可用特制的采样器。采样器有很多种类，图2-4是其中一种。该采样器是一金属框，内装玻璃瓶，其底部装有重沉坠，可据需要下沉到一定深度。瓶盖上系有绳索，拉起绳索，即可打开瓶盖；松开绳索，瓶盖即自行塞好瓶口。水样采集后将水样瓶取出。若测定好氧微生物，则应立即改换无菌棉花塞。

（三）水样的处理

水样采集后，应迅速送回实验室马上检验。若不立即检验，则应放在4℃冰箱内保存。若无低温保存条件，则应在报告中标注水样采集与检验间隔时间。较清洁的水可在12 h以内检测，污水要在6 h内完成检测。

五、实验步骤

1.生活饮用水中大肠菌群的测定

图2-5　MPN法测定大肠菌群初发酵的结果

（1）初发酵试验：对已经处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可做5份10 mL的水样，即通过无菌操作在5支装有5 mL 3倍乳糖蛋白胨培养液的发酵管（或10 mL双料乳糖蛋白胨培养液）中各加入10 mL水样，混匀后置于37℃恒温箱中培养24 h，观察其产酸产气情况（图2-5）。

结果分析：①若培养基紫色，没变为黄色，说明不产酸；小倒管没有气体，说明不产气。此为阴性反应，表明水中无大肠菌群。②若培养基由紫色变为黄色，小倒管有气体，说明产酸产气。此为阳性反应，表明水中有大肠菌群。③若培养基由紫色变为黄色，说明产酸；小倒管没有气体，说明不产气。此仍为阳性反应，表明水中有大肠菌群。④若小倒管有气体，培养基为紫色，也不混浊，说明操作有问题，应重做检验。

结果为阳性，说明水可能被粪便污染，需进一步检验。

（2）确定性实验：用平板划线分离，将培养24 h后产酸（培养基呈黄色）、产气或只产酸而不产气的发酵管取出，通过无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于伊红-亚甲蓝培养基平板上划线分离；共做3个平板。将已接种的平板置于恒温培养箱在37℃下培养18～24 h，观察菌落特征。若平板上长出的菌落具备如下特征，经涂片和革兰氏染色，结果为革兰氏阴性的无芽孢杆菌，则表示水中有大肠菌群。

大肠菌群在伊红-亚甲蓝培养基平板上具有的菌落特征：①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；②紫黑（绿）色，湿润光亮，不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色，中心色较深的菌落；④紫红色的菌落。

（3）复发酵试验：通过无菌操作，用接种环挑取有上述菌落特征、革兰氏阴性的菌落接种于装有10 mL普通浓度的发酵培养基内，每管可挑取同一平板上（即同一初发酵管）的1～3个典型菌落的细菌。将接种的培养基置于恒温培养箱37℃培养24 h，有产酸、产气者证明有大肠菌群，该发酵管则为阳性管。据阳性管数及实验所用的水样量，即可运用数理统计原理计算出每100 mL（或每升）水样中大肠菌群的最大可能数目（most probable number，MPN），见下式：

MPN的数据并非水中实际大肠菌群的绝对浓度，而是浓度的值。为了便于使用，现已制成检索表。根据证实有大肠杆菌群存在的阳性管（瓶）数可直接查阅检索表（附录七中附录-表5），即得结果。

2.水源水中大肠菌群的测定方法之一

（1）稀释水样：据水源水的清洁程度确定水样的稀释倍数。除了严重污染水外，一般稀释度可确定为10-1和10-2，稀释方法同实验2-7中水样稀释法。

（2）初发酵实验：以下均需无菌操作。用移液管吸取1 mL 10-2、10-1稀释水样及1 mL原水样，分别移至装有10 mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，另取10 mL原水样注入盛有5 mL 3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵管中（若较清洁的水样，可再取100 mL水样注入盛有50 mL 3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵瓶中）。将发酵管置于恒温培养箱37℃培养24 h，观察结果。之后实验步骤同生活饮用水的测定。

六、思考题

（1）利用多管发酵法检测大肠菌群的原理是什么？

（2）为何选用大肠菌群作为水的卫生指标？