化学裂解法测定DNA核苷酸序列的Maxam-Gilbert方法

二、Maxam-Gibert化学法测定

图4-19　双脱氧链末端终止法测序基本原理

（引自孙汶生：基因工程学，2004）

1.原理

DNA的化学修饰测定法是1977年由美国哈佛大学的A.Maxan和W.Gibert发明的。在DNA化学测序法中，与碱基发生专一反应的化学试剂在一种或两种特定核苷酸位置上随机断裂3′端或5′端标记的DNA链；用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有不同长度的4套寡聚脱氧核糖核苷酸DNA片段混合物。它们经凝胶电泳分离和放射自显影之后，便可根据X线底片上所显现的相应谱带，直接读出待测DNA链的核苷酸序列，如图4-20所示。

2.测定步骤(www.xing528.com)

化学法测定需要制备各单链末端标记的待测DNA片断，因此，可以选择不同的（α—³²P）dNTP实现单末端标记。在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；在修饰碱基位置化学法断开DNA链；用聚烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开，并根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列（图4-20）。

然而，化学法测序的图谱识读比末端终止法复杂些，每组测序图谱为4～5条垂直的阶梯带。读片时胶底部一个向顶部读，G＋A和T＋C两列中含有相差一个碱基的DNA片段，如果在G＋A中出现一条带，就看G列是否有同样大小的带，如果有即为G碱，若没有则为A碱基；同样，在T＋C中出现条带，就检查C列中有无同样大小条件，有即为C，无则为T。如果做了A＞C反应，在A＞C列中出现较深的带时，可以帮助确定其为A碱基。

图4-20　化学裂解法测定DNA的核苷酸序列