DNA定量方法及应用

DNA定量分析有定磷法、二苯胺法、紫外吸收法等。

（1）定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。

（2）二苯胺法：在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤、2-脱氧核糖、脱氧嘧啶核苷酸，其中2-脱氧核糖在酸性条件下，脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物。

蓝色化合物在595 nm处有最大吸收，且DNA在40～400μg/mL时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

（3）紫外吸收法：利用紫外光分光光度计可以测量样品中的DNA含量，其原理是DNA与蛋白质分别在260及280 nm时吸收峰最高。当OD260=1时，相当于双链DNA、单链DNA或寡聚核苷酸DNA含量分别为50μg、40μg、30μg。

利用核酸在260 nm处有吸收高峰，操作简便，但受蛋白质和核苷酸的干扰和影响。DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260 nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸，都有吸收紫外光的特性。

蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280 nm波长处，在260 nm处的吸收值为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260 nm与280 nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260 nm与280 nm吸收的比值则在1.8以上。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。DNA的A260/A280≈1.9表示DNA纯；＞2.0时可能有RNA污染；＜1.8时可能有蛋白污染。(www.xing528.com)

计算公式：DNA（μg）=（甲A260-乙A260）×V×D/0.02

式中，甲A260为被测稀释液在260 nm处的A值，乙A260为加沉淀剂（过氯酸-钼酸铵）除去大分子核酸后被测稀释液在260 nm处的A值；V为被测试液总体积；D为稀释倍数；0.02为脱氧核糖核酸的比消光系数，即每毫升溶液内含1μgDNA钠盐在波长260 nm，通过光径为1 cm时的A值。

（4）定量胶检测法：荧光染料溴乙啶可嵌入DNA分子的碱基平面之间，在紫外线的照射下发出荧光，其光强度与DNA含量成正比。比较同一凝胶中待测DNA样品与系列标准DNA的荧光强度，确定DNA含量。

（5）人类DNA定量试剂盒：人类总DNA定量检测试剂盒，可使法医学实验室通过单次高度灵敏的实时定量PCR反应，同时获得人总DNA的定量和定性评定结果，可为选择最佳的STR分析化学方法（常染色体或miniSTR）提供指导，并可在增加下游分析成功概率的前提下简化工作流程。

（6）定量PCR仪：实时荧光定量PCR仪，由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。