降解生物胺功能微生物的挖掘与特性分析

（一）降解生物胺菌株的筛选

通过对传统加工腌干鱼中菌株的分离纯化，获得58株乳酸菌疑似菌株，对其进行单一菌种发酵后，Dns-Cl-柱前衍生HPLC-FLD法测定生物胺降解量。结果分离到3株具有生物胺降解能力的菌株，分别编号为MRS1、MRS2、MRS3。菌株鉴定结果见表5-41。其中MRS1经鉴定是鼠李糖乳杆菌（Lr），对腐胺的降解率为30.88%、对组胺的降解率为38.56%、对酪胺的降解率为32.63%；而MRS2为植物乳杆菌（Lp），其对腐胺的降解率为31.29%，对组胺的降解率为26.93%，对尸胺的降解率为35.56%；MRS3为戊糖片球菌（Pp），其对腐胺的降解率最大，达到35.23%，对酪胺的降解率为26.19%，对组胺的降解率为20.56%。说明乳酸菌中确实存在能降解生物胺的菌株。

表5-41　生物胺降解菌鉴定结果

（二）降解生物胺菌株生长曲线测定

由图5-74可知，在前18h，植物乳杆菌的生长速度略高于鼠李糖乳杆菌和戊糖片球菌，并且鼠李糖乳杆菌和戊糖片球菌的生长曲线保持高度一致，18h后才出现差异。18h后鼠李糖乳杆菌的生长速度要明显高于植物乳杆菌和戊糖片球菌，其生长曲线随着时间的延长与其他2个菌株的差异逐渐增大。由图5-74可以看出，3个菌株的菌体密度随着培养时间的延长逐渐增大，在培养6h左右到达对数生长期，培养24h后对数生长期结束，进入稳定生长期，可见，此时是菌体收获的最佳时期。当菌株培养到30h后，菌株生长曲线开始出现下降趋势，这是由于培养基中营养物质消耗殆尽或者菌株自身产生某些代谢毒素。

图5-74　降解生物胺菌株生长曲线

（三）菌株对混合生物胺的降解动力学分析

从图5-75可以看出，分离到的三种菌株均能够同时降解腐胺、尸胺、组胺和酪胺，在24h内，菌株对肉汤培养基中生物胺的降解率逐渐升高，并在24h达到最大降解量，此后基本持平或略有下降。其中，菌株鼠李糖乳杆菌对组胺和尸胺有较强的降解能力，最高分别可达37.87%和37.11%；菌株植物乳杆菌对腐胺和尸胺有较强的降解能力，最高分别可达32.39%和36.39%；菌株戊糖片球菌也表现出较强的腐胺和尸胺降解能力，最高分别达36.92%和27.89%。由此可知，鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌在发酵食品中具有一定的应用潜力。由图5-74和图5-75可得出结论：24h为菌体最佳收获时期，同时也是菌体降解生物胺的最佳时期，如果发酵时间延长，菌体或多或少会产生一些有毒的代谢产物，这将影响鱼肉的品质安全性，所以合适的菌株发酵时间非常重要。

图5-75　三种菌对混合生物胺的降解动力学分析

（四）不同培养条件对生物胺降解菌的影响

1.不同温度对生物胺降解菌的影响

温度对生物胺降解菌的影响如图5-76所示。

图5-76　温度对生物胺降解菌的影响

由图5-76可以看出，在不同的温度处理下，三种菌株对生物胺都有不同程度的降解，在30℃和35℃条件下对生物胺的降解率显著高于20℃、25℃、40℃、45℃时的降解率，这可能是由于3种菌都属于乳酸菌类，其最适生长温度为30～35 ℃。鼠李糖乳杆菌降解腐胺、尸胺、组胺的最适温度为30℃，最大降解率分别为40.68%、35.66%和42.36%，而对酪胺的最适降解温度为35℃，最大降解率为34.28%。植物乳杆菌降解腐胺、尸胺、组胺和酪胺的最适温度均为30℃，最大降解率分别为43.69%、35.39%、36.28%和29.98%。戊糖片球菌降解腐胺、尸胺、组胺和酪胺的最适温度也为30℃，最大降解率分别为38.09%、26.35%、21.01%和28.93%。故3种乳酸菌适合在30～35 ℃的范围内降解生物胺。

2.不同初始pH对生物胺降解菌的影响

初始pH对生物胺降解菌的影响如图5-77所示。

图5-77　初始pH对生物胺降解菌的影响

从图5-77可以看出，三种菌对生物胺的降解能力受培养基pH的影响很大，降解的最适pH是5.5，活性范围为5.0～6.5。如果pH不在这个范围内，降解能力均受到不同程度的抑制。鼠李糖乳杆菌在pH=5.5时对腐胺、尸胺、组胺和酪胺的最大降解率分别为29.38%、38.96%、38.94%和31.63%；植物乳杆菌降解腐胺、尸胺和酪胺的最适pH为5.5，其最大降解率分别达到39.74%、41.23%和26.89%，但是植物乳杆菌降解组胺的最适pH是6.0，最大降解率为29.47%，这可能是由于分离到的植物乳杆菌对组胺的降解以酶降解为主，酸降解发挥着次要作用。有报道提出Natrinema gar HDS3-1也适宜在偏中性的环境中降解组胺。戊糖片球菌在pH=5.5时对腐胺、尸胺、组胺和酪胺的最大降解率分别为28.92%、27.92%、20.73%和26.18%。(www.xing528.com)

3.不同食盐浓度对生物胺降解菌的影响

食盐浓度对生物胺降解菌的影响如图5-78所以。

图5-78　食盐浓度对生物胺降解菌的影响

由图5-78可知，三种乳酸菌在食盐质量浓度为80g/L的培养基中仍然保持着一定的生物胺降解能力，说明从传统加工腌干鱼中分离出的三株菌具备一定的耐盐性，可应用于发酵食品加工中。当食盐质量浓度为0～40g/L时，鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌对四种生物胺均表现出较高的降解率，而当食盐质量浓度达到一定程度（80g/L以上），对该菌降解生物胺有明显的抑制作用。当食盐质量浓度达到160g/L时，三种菌基本丧失了对四种生物胺的降解能力。这是由于高食盐浓度抑制了菌的生长，从而影响菌对生物胺的降解，也可能影响了乳酸菌生物胺氧化酶的生成量或抑制了生物胺氧化酶的活性，而使降解能力下降。已有报道分析组胺降解酶的基本酶学性质，也得出不同温度、pH和食盐浓度会对酶活性造成很大影响。以上结果表明三种菌在食盐质量浓度低于40g/L的体系中生物胺降解性能最佳，在食盐质量浓度40～80g/L的体系中能发挥一定程度的生物胺降解性能，不适用于食盐质量浓度大于80g/L的环境中。

4.不同生物胺底物浓度对生物胺降解菌的影响

生物胺底物浓度对生物胺降解菌的影响如图5-79所示。

图5-79　生物胺底物浓度对生物胺降解菌的影响

由图5-79可知，三种菌随着生物胺底物浓度的增大，其对生物胺的降解率也明显增加，其中，鼠李糖乳杆菌在底物质量浓度100mg/L时对腐胺、尸胺和组胺有最大降解率，分别为39.38%、37.11%和37.87%，在底物质量浓度200mg/L时对酪胺有最大降解率，为33.82%；植物乳杆菌在底物质量浓度200 mg/L时对腐胺、尸胺和组胺有最大降解率，分别为38.73%、38.66%和29.73%，对酪胺的最大降解率出现在底物质量浓度100mg/L时，最大降解率为28.83%；戊糖片球菌在底物质量浓度100 mg/L时对腐胺、尸胺和组胺和酪胺均有最大降解率，分别为38.92%、27.95%、22.83%和29.18%。但是当底物质量浓度高于峰值时，三种菌对生物胺的降解率明显下降，可能由于菌株受生物胺的毒害作用，影响了菌株的生长，从而降低了降解能力。

（五）菌株间拮抗性试验

菌株间拮抗试验结果如表5-42所示。

表5-42　菌株间拮抗试验结果

注：Y表示有拮抗作用，N表示没有拮抗作用。

从表5-42可以看出，鼠李糖乳杆菌和戊糖片球菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌之间存在拮抗作用，而鼠李糖乳杆菌与植物乳杆菌之间无拮抗作用，故本试验选择鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的组合进行腌干鱼类生物胺降解初步应用。

（六）生物胺降解菌对腌干鱼中生物胺的降解效果

在传统法咸鱼的加工工艺基础上，加入相同剂量的具有生物胺降解能力的乳酸菌，制作5种不同类型的咸鱼：CK组为空白组；A组添加鼠李糖乳酸菌（Lr）；B组添加植物乳杆菌（Lp）；C组添加鼠李糖乳酸菌和植物乳杆菌混合菌液［V（Lr）∶V（Lp）=1∶2］；D组添加鼠李糖乳酸菌和植物乳杆菌混合菌液［V（Lr）∶V（Lp）=2∶1］。然后分别检测制作的5种咸鱼的8种生物胺含量，以观察生物胺降解菌对腌干鱼中生物胺的降解效果。实验结果如表5-43所示。

从表5-43中可以看出，在腌干鱼加工过程中加入生物胺降解菌的四组腌干鱼产品中，腐胺、尸胺、组胺含量均显著降低（p<0.05），A组加工的腌干鱼中酪胺的含量未显著降低，但B、C、D组加工的腌干鱼中酪胺含量显著降低（p<0.05），由此可以说明分离出的三种生物胺降解菌均可在腌干鱼加工过程添加，抑制生物胺的产生，有效降解腌干鱼产品中的生物胺。

C组和D组为混合菌组，从表5-43试验结果看，C组加工的腌干鱼产品中腐胺、尸胺、组胺和酪胺含量降幅最明显，分别下降了7.27mg/kg、6.2mg/kg、15.78mg/kg和2.23mg/kg，降解率均达30%以上。因此，V（Lr）∶V（Lp）=1∶2的混合菌种具有应用于降解发酵食品中生物胺的潜力。为提高其对生物胺的降解率，其混合比例和菌液浓度还需后续具体的工艺优化研究。

表5-43　生物胺降解菌对腌干鱼类中生物胺的降解效果

注：同一列相同字母表示差异不显著（p>0.05），不同字母表示差异显著。