肉汤微量稀释法是检测NTM 药物敏感性的标准方法，通常采用对倍稀释的方法，报告时应同时报告MIC值及解释。使用稀释法所获得的MIC并不是真正的MIC。真正的MIC应介于最低抑制浓度及下一个稀释浓度之间，以对倍稀释法为例，如MIC读值是16μg／ml，则真正的MIC应为8～16μg／ml。即使最优条件下进行的两次肉汤微量稀释法所获得的结果也可能有差异，故通常可接受的重复性标准为：两次检测之间的差异为1～2个稀释度。
1.原理非结核分枝杆菌的药物敏感性试验推荐方法是肉汤微量稀释法，并提供了针对鸟分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌以及速生型分枝杆菌的药物敏感性试验操作指南。建议针对其他缓慢生长的非苛养的非结核分枝杆菌，参见堪萨斯分枝杆菌的药敏检测方法及药物。由于这些少见菌其体外药物敏感性试验的结果与临床治疗效果相关性的研究很少，在医生要求对除鸟分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌以及速生型分枝杆菌以外的其他非结核分枝杆菌进行敏感性试验时，应告知临床检测的局限性，并在解释结果时保持谨慎。
2.培养基准备虽然某些慢生型的分枝杆菌在含有5%的OADC、阳离子调整的MH 肉汤培养基中生长不良，但是CLSI还是推荐对慢生型分枝杆菌采用含有5%的OADC、阳离子调整的MH 肉汤作为培养基进行肉汤微量稀释法来检测药物敏感性。对速生型分枝杆菌进行药物敏感性试验时，推荐采用CAMHB作为培养基进行肉汤微量稀释法来检测药物敏感性。
3.菌株准备选择生长良好的固体培养基上的菌株进行药敏试验。也可以直接使用液体培养基中菌悬液。
4.接种液的制备用消毒棉签蘸取足够量的菌落，在含有玻璃珠（7～10颗直径3 mm的玻璃珠）的4.5 ml灭菌水中不断研磨，直至菌液浓度相当于0.5麦氏比浊管浓度（可通过肉眼观察比对，也可采用比浊仪进行比浊）。拧紧盖，在旋涡振荡器上震荡15～20 s，静置使可能存在的细菌团块下沉。用上清液制作接种液。
（1）接种不含液体培养基的冻干型MIC平板
1）速生型分枝杆菌：取0.5麦氏比浊管浓度的菌悬液50μl，加入10 ml经阳离子调节的MH 肉汤中，盖紧瓶盖，颠倒混匀8～10次。
2）慢生型分枝杆菌：取0.5麦氏比浊管浓度的菌悬液50μl，加入10 ml含有5%OADC的经阳离子调节的MH 肉汤中，盖紧瓶盖，颠倒混匀8～10次。
（2）接种到已经含有100μl含有抗生素的液体培养基的MIC平板：通过计算将0.5麦氏比浊管浓度的菌悬液稀释为（1～5）×105 CFU／ml的接种液，再将0.01 ml接种液加入100μl的培养基中，使每个孔0.1 ml的培养基中的最终接种量为（1～5）×104 CFU。
5.孵育用黏性膜密封MIC平板，放入孵育箱进行孵育。
（1）鸟分枝杆菌复合群孵育时间为7 d，如果对照孔生长不良，继续培养10～14 d观察结果。
（2）堪萨斯分枝杆菌的孵育时间为7～14 d，可在含5%～10%二氧化碳的孵育箱中或空气环境中进行，需要注意的是，在进行大环内酯类的药物敏感性试验时，应该避免二氧化碳环境。
（3）海分枝杆菌应在28～30℃孵育7 d，同样可在含5%～10%二氧化碳的孵育箱中或空气环境中进行，需要注意的是，在进行大环内酯类的药物敏感性试验时，应该避免二氧化碳环境。
（4）其他慢生型分枝杆菌：虽然可参考数据比较有限，但是还是其他慢生型分枝杆菌的药敏检测方法与堪萨斯分枝杆菌的检测方法相同。
（5）速生型分枝杆菌应在28～30℃孵育72 h后观察结果，如对照孔生长不良，应继续培养至第四天观察结果，第五天对照孔仍然生长不良，则需要重新进行检测。值得注意的是er m基因可诱导多种速生型分枝杆菌对大环内酯类药物的耐药，故在判读克拉霉素的药敏结果时应注意，如果4 d时克拉霉素未显示耐药（MIC≥8μg／ml）则应至少要等到第14 d。
6.结果判读
（1）鸟分枝杆菌复合群：未经治疗的鸟分枝杆菌复合群对大环内酯类药物产生耐药的可能性是很小的，但是单药治疗数月内可能产生耐药，即使联合用药也可能产生耐药。当检出未经治疗的鸟分枝杆菌复合群对大环内脂类药物耐药时不建议报告临床，应再次确定菌种和复检药敏后再决定是否报告。对于不确定的耐药结果可能提示存在混合感染。详见表8-3-1。
表8-3-1 鸟分枝杆菌复合群对一二线抗分枝杆菌药物判断为耐药的MIC值
（续表）
注：a.克拉霉素是大环内酯类药物，同时也是鸟分枝杆菌复合群唯一需要进行敏感性试验的药物。b.这些药物对MAC体内有效性尚未得到证实。
（2）堪萨斯分枝杆菌：见表8-3-2。
表8-3-2 堪萨斯分枝杆菌对一二线抗分枝杆菌药物判断为耐药的MIC值
注：a.克拉霉素是新型大环内酯类药物的代表，即克拉霉素、阿奇霉素和罗红霉素。b.对服用蛋白抑制剂的患者，利福平检测敏感可认为利福布汀也敏感。c.环丙沙星和左氧氟沙星可以互换，两者体外活性均比莫西沙星低。
（3）海分枝杆菌：见表8-3-3。
表8-3-3 海分枝杆菌对抗分枝杆菌药物判断为耐药的MIC值
（续表）(www.xing528.com)
（4）除MAC及堪萨斯以外的其他慢生型分枝杆菌：见表8-3-4。
表8-3-4 除MAC及堪萨斯以外的其他慢生型分枝杆菌药物判断为耐药的MIC值
（5）速生型分枝杆菌：见表8-3-5。
表8-3-5 速生型分枝杆菌液体培养基肉汤稀释法判读标准
（续表）
注：
a.当实验室发现脓肿分枝杆菌分离株的阿米卡星MIC值为≥64μg／ml时应该重复检测，如复查结果仍然显示MIC值≥64μg／ml，则在结果报告时应备注：实验室已注意这一现象，建议该分离株送往参比实验室进行验证其耐药性。
b.环丙沙星和左氧氟沙星的体外活性低于莫西沙星，且可以互换。
c.克拉霉素是新大环内酯类药物的代表，其最终药物敏感性试验判读结果应在第14 d，以保证诱导型大环内酯类药物耐药性的检出，除非其耐药结果在最终判读之前已经出现耐药。
d.当实验室发现偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌群和M.mucogenicum group的MIC值为＞8μg／ml时，应该重复检测。且孵育时间应不超过3 d。如果复查的结果MIC值仍为＞8μg／ml，则在结果报告时应备注：MIC值高于该菌对亚胺培南的预期值；如果临床考虑使用亚胺培南进行治疗，则应建议将该分离株送往参比实验室验证其耐药性。亚胺培南的结果无法预测厄他培南或美罗培南的结果，因为亚胺培南对速生型分枝杆菌的活性高于美罗培南和厄他培南。
e.判读复方新诺明MIC值时，应该读取能抑制80%菌生长的药物浓度为MIC。
f.只报告MIC值，不做判断。
g.妥布霉素主要用于龟分枝杆菌感染的临床治疗。当实验室发现分离株对妥布霉素的MIC值为＞4μg／ml时，应该重复检测；如果复查的结果仍＞4μg／ml，则在结果报告时应备注：MIC值高于该菌对妥布霉素的预期值；如果临床考虑使用亚胺培南进行治疗，则应建议将该分离株送往参比实验室验证其耐药性。
（6）在判读复方新诺明MIC值时，应该读取能抑制80%菌生长的药物浓度为MIC。
（7）向临床报告MIC值并不是一个绝对的值，准确的MIC值应该在介于实际检测到的MIC值和下一个稀释浓度之间。
（8）推荐同时接种一环最终接种物到营养琼脂板上检测纯度，如5%绵羊血或胰酶大豆琼脂。见图8-3-1。
图8-3-1 速生型分枝杆菌肉汤微量稀释法MIC判读标准
7.质量控制
（1）室内质控：至少每周一次，用适当的质控菌株进行监测以判断整体的质量水平。质控可接受的MIC范围见下页表8-3-6和表8-3-7。
表8-3-6 慢生型分枝杆菌质控菌株质控时可接受的MIC范围
表8-3-7 速生型分枝杆菌质控菌株质控时可接受的MIC范围
注：a.无采用当前推荐的方法进行的研究。b.MIC值提示80%的细菌生长受抑制。
（2）无菌试验：每批次一次无菌试验，将准备接种菌悬液的微孔板进行孵育过夜，检测培养基中有无细菌生长。
（3）批间质控：每批次一次质控，选择适当的质控菌株进行检测，用以确定该批次试剂的MIC在预期范围内。
（4）纯度质控：每个样本必须进行纯度质控。纯度质控包括两方面。①检测是否有普通细菌混合，挑取适量接种液接种于合适的琼脂平板（巧克力琼脂或者胰蛋白酶大豆琼脂），孵育过夜，观察是否有普通细菌生长。②检测是否有多种分枝杆菌混合，挑取适量接种液接种于7 H10或7 H11培养基（怀疑有嗜血分枝杆菌时需要使用巧克力琼脂接种），孵育足够长时间观察是否有多种分枝杆菌生长；另一用途是可以为复检准备新鲜菌株。
（5）终点解读质控：人员比对，与有丰富经验的工作人员进行对比，两者判读结果相差上下一个浓度内可判断为一致，否则为不一致，建议重新进行人员培训，以保证结果判读的一致性。
8.药敏报告的信息药敏报告单内容必须包括试验方法的名称、药物种类、药物浓度以及判断的结果（有折点判断标准时）。当使用商品化非结核分枝杆菌药敏测试试剂如Sensititre RAPMYCOI、SLOMYCO时，结果报告应遵循厂家说明书规定。
（作者：余方友 校审：吴文娟）
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