细菌分离与培养：试管斜面接种法

一、实验目的

通过实验掌握斜面接种培养技术。

二、实验原理

试管斜面接种法是将长在斜面培养基、平板培养基或液体培养基上的微生物接种到斜面培养基上的方法。该法能减少试管被其他微生物污染的概率。在微生物实验过程中，最重要的一点是实验必须在无菌的情况下进行，尽量减少试管的污染机会。细菌的试管斜面接种最适合在菌种转移及菌种纯化中使用。

三、实验仪器和材料

（1）高压蒸汽灭菌器、生化恒温培养箱、净化工作台。

（2）玻璃器皿：三角瓶、试管、烧杯、移液管（1 mL、10 mL）、培养皿、玻璃棒等。

（3）带菌种的斜面培养基试管或带菌种的平面培养基或废水、活性污泥、土壤悬液、湖水或河水1瓶。

（4）试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、琼脂、pH试纸、蒸馏水（或无菌水）等。

（5）其他：接种环、天平、药匙、纱布、脱脂棉、牛皮纸、橡皮筋、酒精灯等。

四、实验步骤

1.稀释样品

样品稀释参考浇注平板法中水样稀释方法。

2.牛肉膏蛋白胨培养基的制备

用天平分别称量：牛肉膏0.75 g、蛋白胨2.5 g、氯化钠1.25 g、琼脂2.5～5 g、蒸馏水250 mL（有时也可用自来水），依次加入烧杯中，混合后在电炉上加热，不断搅拌以免糊底，直至完全溶解。过滤去除沉淀，加水补足因加热蒸发的水量，用氢氧化钠溶液（或盐酸）调pH至7～8，倒入三角烧瓶中。120℃灭菌15～30 min，待用。

3.斜面的制作

将已灭菌冷却至50℃～60℃的培养基倒入试管，将试管摆放成一定的斜度，斜面高度不超过试管总高度的1/2（图1-37）。摆放时不可使培养基污染棉塞，冷凝过程中请勿再移动试管。待斜面完全凝固后，待用。(www.xing528.com)

图1-37　斜面的摆放

4.斜面接种培养

（1）创造无菌区域。点燃酒精灯，在火焰附近形成无菌区。

（2）手握试管。左手夹住菌种管及待接种的斜面培养基试管。

（3）准备接种。用右手小指与无名指相夹或用右手小指和无名指与手掌相夹拔出棉塞，并将试管口在火焰上来回移动2～3次，在火焰附近以45℃角斜握于左手中，斜面向上（图1-38）。

图1-38　斜面接种示意图

（4）接种环灭菌。用右手将接种环在火焰上灼烧至环及以上金属部分烧红。接种环在每次使用前、后，都要在酒精灯火焰上灼烧灭菌。

（5）接种。将烧过的接种环伸入菌种管内，使接种环轻触管壁无菌处，待接种环冷却后挑取少量菌种，立即转至待接种管中，自斜面底端向上轻轻划Z形曲线或波浪线至斜面顶端。注意接种划线时切勿划破培养基，以免影响培养菌种。

（6）培养。抽出接种环，已接种试管口通过火焰，塞上棉塞，送恒温生化培养箱37℃培养24～48 h。火焰上灼烧接种环灭菌后放回原处。注意接种环进出试管过程中勿触碰管壁、管口或管外物品。

（7）观察、记录、分析结果。

五、思考题

（1）斜面接种需注意哪些问题？

（2）简述试管斜面接种的优缺点。