微生物无菌检验与细菌接种方法要求

无菌操作是指在无菌环境下进行的细胞传代培养、植物组织培养、细菌接种等操作,目的是防止微生物进入人体组织或其他无菌范围。无菌操作是微生物检测中的重要概念,只有在培养基、检测设备等处于无菌的前提下,样品才可能不受污染,才可能实现微生物检测的准确、可靠。

(一)无菌操作基本要求

1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。

2.进行接种食品样品时,必须穿专用的工作服、帽及拖鞋,应放在无菌室缓冲间,工作前经紫外线消毒后使用。

3.接种食品样品时,应在进无菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球将手擦干净。

4.进行接种所用的吸管,平皿及培养基等必须经消毒灭菌,打开包装未使用完的器皿,不能放置后再使用,金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

5.从包装中取出吸管时,吸管尖部不能触及外露部位,使用吸管接种于试管或平皿时,吸管尖不得触及试管或平皿边。

6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作,接种细菌或样品时,吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝,必要时还要烧到环和针与杆的连接处,接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5 min,再经火焰烧灼。

8.吸管吸取菌液或样品时,应用相应的橡皮头吸取,不得直接用口吸。

9.无菌间使用前后应将门关紧,打开紫外灯,如采用室内悬吊紫外灯消毒时,需30 W紫外灯,距离在1.0 m处,照射时间不少于30 min,使用紫外灯,应注意不得直接在紫外线下操作,以免引起损伤,灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭,除去上面灰尘和油垢,以减少紫外线穿透的影响。

10.处理和接种食品标本时,进入无菌间操作,不得随意出入,如需要传递物品,可通过小窗传递。

(二)消毒灭菌要求参见第二章第四节内容。

(三)食品样品处理

由于食品样品种类多,来源复杂,各类预检样品并不是拿来就能直接检验,要根据食品种类的不同性状,经过预处理后制备成稀释液才能进行有关的各项检验。样品处理好后,应尽快检验。

1.液体样品：液体样品指黏度不超过牛乳的非黏性食品,可直接用灭菌吸管准确吸取25 mL样品加入225 mL蒸馏水或生理盐水及有关的增菌液中,制成1∶10稀释液。吸取前要将样品充分混合,在开瓶、开盖等打开样品容器时,一定要注意表面消毒,无菌操作。用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌,用石炭酸纱布盖好,再用灭菌开瓶器将盖打开。含有二氧化碳的液体饮料先倒入灭菌的小瓶中,覆盖灭菌纱布,轻轻摇荡,待气体全部逸出后再进行检验。酸性食品用100 g/L灭菌的碳酸钠调pH至中性后再进行检验。

2.固体或黏性液体食品：此类样品无法用吸管吸取,可用灭菌容器称取检样25 g,加至预温45℃的灭菌生理盐水或蒸馏水225 mL中,摇荡溶解或使用振荡器振荡溶解,尽快检验。从样品稀释到接种培养,一般不超过15 min。

(1)固体食品的处理：固体食品的处理相对较复杂,处理方法主要有以下几种。

1)捣碎均质法：将100 g或100 g以上样品剪碎混匀,从中取25 g放入带225 mL无菌稀释液的无菌均质杯中,以8000～10000 r/min均质1～2 min,这是对大部分食品样品都适用的办法。

2)剪碎振摇法：将100 g或100 g以上样品剪碎混匀,从中取25 g进一步剪碎,装入带有225 mL无菌稀释液和适量直径为5 mm左右的玻璃珠的稀释瓶中,盖紧瓶盖,用力快速振摇50次,振幅不小于40 cm。

3)研磨法：将100 g或100 g以上样品剪碎混匀,取25 g放入无菌乳钵充分研磨后再放入盛有225 mL无菌稀释液的瓶中,盖紧瓶盖后,充分摇匀。

4)整粒振摇法：有完整自然保护膜的颗粒状样品(如蒜瓣、青豆等)可以直接称取25g整粒样品置入带有225mL稀释液和适量玻璃珠的无菌稀释瓶中,盖紧瓶盖,用力快速振摇50次,振幅在40 cm以上。

(2)冷冻样品的处理：冷冻样品在检验前要进行解冻。一般可0℃～4℃解冻,时间不超过18 h;也可在45℃以下解冻,时间不超过15 min。样品解冻后,无菌操作称取检样25 g,置于225 mL无菌稀释液中,制备成均匀的1∶10混悬液。

(3)粉状或颗粒状样品的处理：用灭菌勺或其他适用工具将样品搅拌均匀后,无菌操作称取检样25 g,置于225 mL灭菌生理盐水中,充分振摇混匀或使用振荡器混匀,制成1∶10稀释液。

(四)检验与报告

1.检验

检验样品送到实验室后,立即将样品置于普通冰箱或低温冰箱中,并进行登记、填写实验序号,按检样检验要求,积极准备条件进行检验。

样品收集后应于36 h内检验。食品微生物检验按国标检验方法规定,主要检验项目包括菌落总数、大肠菌群和致病菌的检验,其中致病菌的检验包括肠道致病菌检验和致病性球菌检验等。

2.报告

按检样项目完成各类检验后,检验人员应及时填写检验报告单,签名后送主管人员核实签字,加盖单位印章,以示生效,立即交食品卫生监督人员处理。

实验室必须具有专用冰箱存放样品,对于一般阳性样品,在发出报告后3天(特殊情况可适当延长)方可处理样品;进口食品的阳性样品,需保存6个月,才可处理;而对于阴性样品可及时处理。

(五)有毒有菌污物处理要求

微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理,一律不得带出实验室。

1.经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内,并集中存放在指定地点,待统一进行高压灭菌。

2.经微生物污染的培养物,必须经121℃,30min高压灭菌。

3.染菌后的吸管,使用后放入5%煤酚皂溶液或碳酸液。

4.涂片染色冲洗片的液体,一般可直接冲入下水道。(www.xing528.com)

5.打碎的培养物,立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液;污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩。

(六)细菌接种方法简介

细菌的常用接种方法有平板划线分离法、斜面接种法、穿刺接种法、液体和半固体接种法、涂布接种法、螺旋接种法等。

1.平板划线分离法

平板划线分离法简介及原理：是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面,通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞,经培养后生长繁殖成单个菌落,通常把这种单个菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单个菌落并非都由单个细胞繁殖而来的,故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。划线分离主要有分区划线法和连续划线法两种。

1)分区划线法操作(如图2-16)：是将平板分四区,故又称四分区划线法。先将接种环蘸取少量菌在平板1区划3～5条平行线,取出接种环,左手关上皿盖,将平板转动60°～70°,右手把接种环上多余菌体烧死,将烧红的接种环在平板边缘冷却,再按以上方法以1区划线的菌体为菌源,由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕,同时再把平皿转动约60°～70°,同样依次在3、4区划线。划线完毕,灼烧接种环,关上皿盖。划线时每次将平板转动60°～70°划线,每换一次角度,应将接种环上的菌烧死后,再通过上次划线处划线;

2)连续划线法操作(如图2-17)：是将琼脂平皿半开盖倒置于培养箱内至无冷凝水,接种环于酒精灯外焰烧至红透,接种棒也要充分灼烧,最后再集中烧接种环至红。轻轻摇匀待接种试管,左手手心托待接种试管底侧部,右手执接种环,右手小指拔下试管塞,于酒精灯附近将接种环伸进试管,稍候,再插入待接种液中,蘸一下,取满一环,抽出、烧塞、盖盖、放回试管架。或将接种环通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板,在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后以无菌操作接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。用左手小指和无名指托接种的平皿底部,中指和拇指捏平皿盖,于靠近酒精灯处打开平皿盖约30°,右手将环伸进平皿,将菌种点种在平板边缘一处,轻轻涂布于琼脂培养基边缘,抽出接种环,盖上平皿盖,然后将接种环上多余的培养液在火焰中灼烧,打开平皿盖约30°伸入接种环,待接种环冷却后,再与接种液处轻轻接触,开始在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集,充分利用平板表面积,注意勿使前后两条线重叠,划线完毕,关上皿盖。灼烧接种环,待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养(以免培养过程皿盖冷凝水滴下,冲散已分离的菌落)。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态,镜检后再接种斜面。

图2-16　平板划线法　

图2-17　划线分离示意图

2.斜面接种法

斜面接种法简介及原理：斜面接种法是指将单个菌落培养于斜面上,该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。

斜面接种法操作：左手平托两支试管,拇指按住试管的底部。外侧一支试管是斜面上长有菌苔的菌种试管,内侧一支是待接的空白斜面,两支试管的斜面同时向上。用右手将试管塞旋松,以便在接种时容易拔出。右手拿接种环(如握毛笔一样),在火焰上先将环端烧红灭菌,然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。将两支试管的上端并齐,靠近火焰,用右手小指和掌心将两支试管的试管塞一并夹住拔出,试管塞仍夹在手中,然后让试管口缓缓过火焰。注意不得将试管塞随意丢于桌上受到蘸污,试管口切勿烧得过烫以免炸裂。将已灼烧的接种环伸入外侧的菌种试管内。先把接种环的先端触及无菌苔的培养基上使其冷却(如果操作迅速,此时接种环尚未完全冷却)。再根据需要用接种环沾取一定量的菌苔,注意勿刮破培养基。将沾有菌苔的接种环迅速抽出试管,注意勿使接种环碰到管壁或管口上。迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部,轻轻向上划线(直线或曲线,根据需要确定),勿划破培养基表面。接好种的斜面试管口再次过火焰,试管塞底部过火焰后立即塞入试管内。将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼,使其干燥后,再在外焰中烧红,以免菌苔骤热,会使菌体爆溅,造成污染。放下环后,再将试管塞旋紧,在试管外面上方距试管口2～3 cm处贴上标签。8℃～37℃恒温培养。斜面接种方法及无菌操作过程如下具体操作过程如图2-18。

图2-18　斜面接种无菌操作示意图

3.穿刺接种法

穿刺接种法简介及原理：穿刺接种法是指挑取少量菌种,并把它穿刺到固体或半固体培养基上的一种方法,经穿刺后的菌种,常作为保存菌种的一种形式,同时也是检查细菌运动能力的一种方法,它只适宜于细菌和酵母菌的培养方法。

穿刺接种法操作(图2-19)：用接种针经火焰灭菌,蘸取少量菌种,垂直地穿入试管固体培养基中心至底部,然后将挑起菌落的接种针平行于管壁插入琼脂斜面底部、沿着原接种线将针拔出、烧试管塞和试管口、塞上试管塞,再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。要做到手稳、动作轻巧快速。

图2-19　穿刺接种的两种方法

a.垂直法b.水平法

4.液体和半固体接种法

(1)液体接种法：包括从外面菌种接入培养液,或从液体菌种接入液体培养液,两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下,液体接种宜采用移液管接种,要求无菌操作。

方法：左手持试管,右手将烧灼过的接种环伸入菌种管,待冷却后,取菌液一环,立即移入培养基管中,在接近液面的管壁上轻轻研磨,然后将试管稍倾斜,并蘸取少许液体调和,使菌液混合于培养基中(图2-20)。

图2-20　液体养基接种法

(2)半固体培养基按种法

将烧灼过的接种针插入菌种管冷却后,蘸取菌液少许,立即垂直插入半固体培养基的中心至接近于管底处,但不可直刺至管底,然后循原路退出。管口通过火焰,塞上棉塞,接种针烧灼灭菌后放下。将上述已接种好的培养物,37℃恒温箱内培养,24 h后取出观察结果。

5.涂布接种法

将琼脂平皿半开盖倒置于培养箱内至无冷凝水,用无菌移液管吸取菌悬液0.1 mL,滴加于培养基平板上,右手持无菌玻璃涂棒,左手拿培养皿,并用拇指将皿盖打开一缝,在火焰旁右手持玻璃涂棒与培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散,切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破,如图2-21。接种后,将平板倒置于恒温箱中,培养观察。

图2-21　涂布接种操作过程示意图

6.螺旋接种法

螺旋接种方法创建于1973年,全自动化的细菌接种工作由埃德坎贝尔博士在美国食品药物管理局研究,并与好朋友弗朗索瓦雅朗克于1992年申请专利的最新方法。此法主要用于菌落总数计数,可以在无任何全部或中间稀释的情况下快速细菌接种。对数减少的样品容量以阿基米德螺旋线的形式被自动分注在旋转式培养基表面。培养基上每一点的容量可以被知晓和校准。菌液的浓度可以通过培养皿上一定区域的菌落数量除以同区域样品分注量来计算。优点是螺旋接种法菌液无须稀释,其他接种方法均需经过梯度稀释才能计菌落数。可节省3/4的耗材和时间。但是,产品成本高,适用于样品量比较大的实验。

(七)微生物检验过程相关设备的应用

食品中微生物检验过程是一个时间长、环节多的复杂检验过程,有样品处理、增菌、分离和鉴定等环节,每个环节都需要洁净环境或生物安全防护,因此在微生物检验过程中会应用到很多检验设备和辅助设备,如：生物安全柜、超净工作台、重量稀释仪、均质器、螺旋接种仪、移液器(手动、电子)、膜过滤系统、红外线加热消毒器(接种环灭菌)、免疫磁珠仪等。