兰科花卉组织培养：快速繁殖方法与优化要点

二、兰科花卉的组织培养

（一）蝴蝶兰的组织培养

蝴蝶兰（phalaenopsis）为兰科蝴蝶兰属植物，它是一种热带气生兰，俗称“洋兰”。蝴蝶兰花型似蝴蝶，形态美妙、色彩丰富、花期长，在热带兰中素有“兰花皇后”之美称。蝴蝶兰种类丰富、分布广，东起菲律宾、新几内亚，南达澳大利亚北部、西苏门答腊，北到我国台湾、云南、四川西部均有原种（野生的蝴蝶兰）存在，约有50多种。蝴蝶兰的组培快繁从离体器官诱导产生类原球茎（种子萌发时先是胚的膨大，种皮破裂，一定时间后发育成肉眼可见浅黄色的原胚呈球状，称为原球茎，由其他外植体诱导产生的称类原球茎）开始，通过类原球茎的增殖培养，得到大量组培幼苗。类原球茎是一类呈珠粒状的幼嫩器官，在兰科植物中多以这种器官发育、增殖和分化。蝴蝶兰的组培快繁有胚培养、叶片培养和腋芽培养，再以丛生芽的方式增殖快繁，可以有效地保持母本的优良性状，变异率最低。蝴蝶兰组培技术流程具体如下：

1．材料消毒与接种

取已过盛花期带休眠芽的花梗作为外植体材料，切下其带芽茎段，长约2～3cm，用自来水清洗干净，在饱和漂白粉上清液中浸泡15min，浸泡时不断搅动，浸泡后的茎段用流水冲洗干净，置于超净工作台上，先用75%的酒精消毒30s，无菌水清洗1次，再用0.1%的升汞浸泡10min，经无菌水冲洗数次，将带芽茎段接种到诱导培养基上。

2．培养基的配制

花梗腋芽诱导培养基：1／2MS＋BA2.5mg·L^－1＋NAA0.2mg·L^－1。

增殖培养基：1／2MS＋BA3.5mg·L^－1＋KT1.0mg·L^－1＋NAA0.5mg·L^－1＋椰乳10%。

生根培养基：1／2MS＋BA1.5mg·L^－1＋NAA0.3mg·L^－1＋80g·L^－1香蕉泥。

以上培养基pH均为5.5，培养环境每天光照12h，光强1600lx，温度25±2℃。

3．培养效果

①诱导培养效果。蝴蝶兰花梗接种到芽诱导培养基上，生长1周后在花梗的基部有褐色物质产生，腋芽开始萌动，1月后腋芽可以长到1.5cm高，出芽率可达50%。

②增殖培养效果。将长出的芽选取约1.5cm的苗，取出后切去基部褐化部分，转接到增殖培养基中，40d后，增殖倍数可达到3倍以上。

③生根培养效果。将高约3cm以上的苗接种到生根培养基中50d后，全部生根，平均生根3.5条，根长约2.5cm。

4．壮苗培养与驯化移栽

壮苗所需的生根组培苗壮苗培养基：1／2MS＋蔗糖10g·L^－1＋琼脂粉3.5g·L^－1＋活性炭1.5g·L^－1，pH5.4，温度（25±2）℃，光照强度2000lx，光照时间14h·d^－1。培养15d后成壮苗。

驯化：室内开瓶炼苗3d＋室外炼苗3d。移栽基质：最适合的栽培基质为水苔，椰糠也是良好的移栽基质。

5．组培过程中褐化问题及解决

蝴蝶兰和其他兰科植物一样，在组培快繁生产中存在着易褐化死亡的问题，因此如何克服褐变成了组培快繁生产成功与否的关键，活性炭2g·L^－1或PVP1g·L^－1效果显著；适时切除培养物的褐化部分并及时更换新鲜培养基，能有效抑制外植体褐变死亡；培养基中加入10%椰子水，也能促进原球茎的生长，减少原球茎增殖过程中的褐变；蝴蝶兰的群体效应很明显，单芽容易褐化死亡，且增殖较慢，因此，刚诱导出的芽或原球茎不能过早切割转移，在继代阶段接种时，应尽量避免切成单芽，增殖时切块也不宜过小，否则容易褐化死亡；添加香蕉汁对蝴蝶兰原球茎形成及幼苗生长具有明显的促进作用。

蝴蝶兰快繁，由于蝴蝶兰品种差异及外植体来源不同对最适培养基的选择、细胞分裂素／生长素组合、添加物选择、蔗糖浓度等因素都应根据实际情况进行试验、筛选及优化。

（二）中国兰的组织培养

中国兰花又称国兰，按花期可大致分为：春兰（C．gogeringii）、建兰（C．ensifololiunm）、寒兰（C．kanran）、墨兰（C．sinense）等，其味幽香，花色淡雅，具有很高的观赏价值。国兰组培再生植株程序是：从外植体／种子开始诱导形成原球茎、类原球茎和根状茎，大量增殖后分化出小植株、生根壮苗培养、驯化和培育成苗。在国兰组培中，受技术、母体数量等因素制约，外植体种类相对较少，使用较多并较易获成功的是顶芽和腋芽，一般认为顶芽优于腋芽。但对稀有名贵的国兰品种而言，使用顶芽等于损失了苗，代价太大。春兰、墨兰、建兰等均可用苞叶未展开的新芽的茎尖诱导出大量的类原球茎，类原球茎发育成根状茎后，进一步长成幼苗；茎尖及侧芽带1～2个叶原基的茎圆锥成活率高，中间部位侧芽成活率较高，从长l～2cm、苞叶未展开的新芽上切取茎尖则成功率更高，过小的外植体不但活力弱，而且分裂增殖的部位少，过大的外植体，诱导困难容易褐化死亡。兰花种子非常细小，每粒种子长约1～2mm，直径0.1～0.2mm，且种子内的胚多半不成熟或发育不完全，种皮致密、透性差或种皮中含有抑制物，难以在自然条件下萌发，但通过种子试管内共生萌发或非共生萌发可获得新的小植株。大部分的兰花种子可通过无菌萌发的方式进行萌发，其中附生或半附生兰和气生兰及杂交后代的种子萌发较易，而地生兰种子的萌发较难。

中国兰组织培养因品种和阶段不同对培养基要求、蔗糖浓度、植物生长物质组合、培养方式与条件都是不同的，需要经过筛选和优化。另外，如国兰的试管苗移栽后生长缓慢和开花迟的问题、天然提取物在组培中的作用和兰花共生菌根及其应用都仍需要进一步研究。

1．建兰的组织培养

用永福素品种为材料。取3～7cm长、生长健壮、叶片尚未展开的新生芽，用自来水冲洗干净。用70%酒精浸泡15s，再用无菌水冲洗2遍，然后用0.1%升汞灭菌10min，最后用无菌水冲洗4～5次，在无菌条件下剥取茎尖组织和侧芽（腋芽）作为组培外植体。

诱导原球茎培养基选用改良的MS（大量元素、微量元素减半）＋NAA6mg·L^－1＋10%椰子汁，pH5.4，茎尖及侧芽外植体在诱导原球茎的培养基中，温度25±3℃，暗培养120d，可诱导出原球茎。用较大外植体，适当降低培养的温度，进行暗培养可以减轻褐化。

原球茎增殖培养基选用MS＋NAA1～2mg·L^－1＋10%椰子汁＋0.1%活性炭，pH5.4，原球茎转到增殖培养基，温度25±3℃，光照强度1000lx，12h·d^－1的条件下进行培养。30d后增殖了6倍，长出根状茎，每茎分枝数达8个。

根状茎分化出芽和生根培养基选用1／2MS＋BA2mg·L－1＋NAA0.2mg·L－1＋10%香蕉泥，pH5.4，根状茎转入根状茎分化培养基，约30d后，根状茎顶端开始分化形成芽，再经过20d左右，芽基部分化出根，形成完整的植株。出苗较快，整齐，植株根系健壮。根状茎的分割不可太小，培养群体不宜太少，否则根状茎生长不良，甚至死亡。

试管苗的移栽。兰花试管苗适应外界条件的能力较差，移栽养护技术难度较大。小植株形成后再经过30～45d的培养，当试管苗长6～8cm有3片真叶时，进行7d的室温炼苗。移栽前，将黏附在根系上的培养基洗净（注意不可伤根），用0.2%甲基托布津溶液浸泡15min，然后移栽栽培基质中，保持温度15～25℃、空气相对湿度80%左右的条件下进行养护，并定期施用营养液。(www.xing528.com)

2．中国春兰原球茎的诱导和增殖

中国春兰是中国兰花大家族中品种最丰富多彩的一个种，也是繁殖最困难的品种之一，一般繁殖系数很低，最多1年2～3倍，而那些名贵品种繁殖系数更低些。随着国兰野生资源日益稀缺，加快国兰的繁殖速度，更好地保护国兰品种资源，是我国兰花科学研究的重要任务。

（1）材料消毒与接种

中国春兰（Cymbidium goeringi Rchb．f．）品种，取芽或种荚。先用洗洁精泡洗30min，自来水冲洗干净，然后在超净台上用75%酒擦洗外表，再在1%升汞中浸洗约5～6min，用无菌水反复冲洗3～4次，搁干。切去茎芽外包被，解剖种荚，取芽尖或种子接种于原球茎诱导培养基。

（2）培养基配制

诱导培养基：1／2MS＋0.7%琼脂糖＋30g蔗糖＋0.01%活性炭，pH值为5.4～5.6。

增殖培养基有A、B两种。A号：1／2MS＋0.25mg·L^－1BA＋0.01mg·L^－1NAA＋0.7%琼脂糖＋30g·L^－1蔗糖＋0.1%活性炭，pH值为5.2～5.4；B号：1／2MS＋0.25mg·L^－1BA＋0.10mg·L^－1NAA＋30g·L^－1蔗糖＋0.1%活性炭，pH值为5.2～5.4。

（3）培养效果

原球茎的诱导：茎尖接入诱导培养基后，4～6个月诱导出芝麻大小浅绿色原球茎。

原球茎的增殖：原球茎转接到增殖培养基A号，培养1～2个月原球茎长至米粒大小，转接到增殖培养基B号，交替培养2～3次，原球茎增殖速度加快，形成由许多原球茎组成的指状大小原球茎团，原球茎增多可切割成数小块，置于全震荡培养箱内培养，温度控制在24～26℃，转速调至80～100rpm。约15～20d，几乎每个原球茎上可长出3～4个白色籽麻粒大小原球茎，约30～40d，原球茎多的可增加到十余个，大的长至米粒大小，这样分割继代培养多次，原球茎增殖系数可大大提高。

3．大花惠兰（Cymbidium hybridium）的组织培养

（1）材料消毒与接种

取大花蕙兰大花品种嫩芽。将母株放在温室内盆栽培养，于2～5月陆续从母株上取8cm左右的新芽，剥去最外几层叶片，取芽的上半段，然后在超净工作台上，先在70%的酒精中处理6s，立即投入10%的次氯酸钠溶液中10min，稍加摇动，取出后用无菌水冲洗，剥去外层2～3片叶片，再放入5%的次氯酸钠溶液中5min，取出后用无菌水冲洗，剥至最后1片叶，再放入1%的次氯酸钠溶液中1min，取出后无菌水冲洗数次。以上次氯酸钠溶液中均加入吐温20。在无菌条件下剥出约5mm长的茎尖，以生长点为中心，用解剖刀把茎尖切成4个小方块，分别接入已经准备好的培养基上。

（2）培养基配制

原球茎诱导培养基：MS＋0.5mg·L^－1BA＋1.0mg·L^－1KT＋2g·L^－1活性炭（active carbon，AC）。

原球茎增殖培养基：MS＋0.5mg·L^－1BA＋0.8mg·L^－12，4-D＋2g·L^－1AC。

幼苗分化及生根养基：MS＋KT1mg·L^－1＋NAA0.5mg·L^－1＋2g·L^－1AC。

（3）培养条件

培养基pH5.4～5.8，琼脂粉0.6%～0.8%，培养室温度22～25℃，相对湿度40%，光照12h·d^－1，光照强度为2000lx。

（4）培养效果

原球茎诱导：把茎尖切成的小块，接入圆球茎诱导培养基，25～35d后可出现圆球茎。

原球茎增殖：将诱导形成的较大圆球茎块切割成直径3～8mm左右的小块，接种在圆球茎增殖培养基上，1个月后可统计增殖量。

幼苗分化及生根：将较大原球茎块切割成直径3～8mm的小块，接种在原球茎分化及生根培养基上。45d后分化幼苗、生根。

（5）壮苗、驯化与移栽

壮苗：1／2MS，7%琼脂，pH5.4～5.6，光照2000lx下5～6周后植株长出粗壮的根系。

驯化：将瓶苗放置在23cm×30cm×8cm四周镂空的塑料框中，从培养室移至常温室内放置2d后，去瓶盖炼苗3～7d，洗净瓶苗根部的培养基，用1000倍甲基托布津或多菌灵浸泡组培苗根部，放置于通风阴凉处晾干水分至根系发白变软，即可用于移栽。

移栽：基质采用水苔（或谷麦壳2∶河沙1∶珍珠岩1（体积））是大花蕙兰组培苗移栽的理想基质；白天平均温度在20℃以上，夜间温度在15℃左右，相对湿度控制在80%以上。晴天上午10：00至下午5：00作70%的遮阴处理，大花蕙兰刚出瓶的植株很小、十分脆弱，放置处要求光照弱，种后用喷雾器将苗株与植材喷洒到湿润为止。每天向叶片喷水数次，保持湿润，切忌过干或过湿。10d后才逐渐增加给水量。良好的浇水管理措施，可大大提高瓶苗移栽成活率。瓶苗移栽20d以后新根长出，可逐渐增加光照强度。每周进行1次根外追肥，可用“花宝1号”或“通用肥”2000倍液喷洒。

通常情况下，在原球茎增殖的继代培养中，20～25d继代1次较为合适，此时产生的原球茎未充分成熟，增殖率较高，颜色为鲜绿色；原球茎切割块的大小以直径0.5cm，每瓶可接种30多个培养块为适宜，过小易死亡，降低增殖率；在培养基中加入2g·L^－1活性炭可以有效地降低褐变率；分化及生根培养时原球茎切割的块越大分化得越早，幼苗长得越壮。同一培养基中培养的时间越长分化率越高，分化和生根可以同步进行。