荧光抗体染色方法在畜禽疫病诊断中的应用及优缺点

二、荧光抗体染色方法

1．直接法荧光抗体染色

染色前将荧光抗体稀释至工作浓度，标本片做好记号置湿盒内，然后用毛细吸管吸取荧光抗体，加于载波片标本上，置37℃水浴30min（在此期间注意勿使荧光抗体流掉而使标本干燥）。染好的标本片首先放入蒸馏水（pH7．4）中，即刻取出，以洗去大量的荧光抗体，再放入0．01mol／LpH8．0PBS中振荡洗涤5min，这样反复洗涤三次，将未反应的荧光抗体洗尽、甩干，加一滴封裱剂（9份甘油、1份pH9．5碳酸缓冲液）封片，即可镜检。

关于染色条件，对各种不同标本及抗原需要事先通过试验确定染色常规，主要包括荧光抗体浓度，染色时间，温度及pH等。对不耐热抗原应在低温下进行染色，即在4℃～5℃下过夜，这样会得到较好的效果。

与其他染色方法相比，直接法最简单、可靠、特异性强，但其缺点是敏感性不如间接法和补体法，此外，直接法针对每种抗原需要制备不同的荧光抗体，颇不方便。

2．间接法和补体法荧光抗体染色

方法与直接法基本相同，从略。(www.xing528.com)

3．抑制试验（封闭试验，或阻断试验）

分为一步法和二步法两种。

（1）一步法：标本上滴加一定稀释度的免疫血清及荧光抗体的混合液，37℃浸染30min，洗涤后镜检，应不被荧光抗体着色。

（2）二步法：标本上先滴加未标记的免疫血清在37℃作用30min，经充分水洗后再滴加荧光抗体，37℃复染30min，洗涤后标本不被荧光抗体着色或着色很浅。

4．吸收试验

荧光抗体与相应抗原混合置37℃30min至60min，离心，用上清液浸染标本，应不出现特异性荧光。