荧光定量分析在仪器分析中的应用

1.荧光强度与浓度的关系

荧光是由物质吸收光能之后发射的光，所以，溶液的荧光强度和该溶液吸收光的程度以及溶液中荧光物质的荧光量子效率有关。溶液被入射光激发后，可以在溶液的任何方向观察到荧光强度，但由于激发光的一部分被透过，因此在透射光方向上观察荧光就不合适，一般选择在与激发光传播方向垂直的位置上检测，如图3-8所示。

图3-8　检测溶液荧光的方位示意图

设入射光（激发光）强度为I0，透射光强度为I，荧光强度为F，它正比于被荧光物质吸收的光强度，即F∝(I0-I )，

式中，K′为与物质荧光效率有关的常数，根据Lambert-Beer定律，则有

将式（3-2）代入式（3-1），得

将式中的指数项展开，得

将式（3-4）代入式（3-3），得

当浓度很小时，ECl≤0.05，式（3-5）中第二项以后的各项可以忽略，则有

在给定的测定条件下，式（3-6）中各个参数，除c外都是常数，令K=2.3K′I0El，则有

所以在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系，这就是荧光定量分析的依据。当浓度较大时，Ecl>0.05，式（3-5）中第二项以后的各项就不能忽略，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度不呈线性关系，计算比较复杂。所以，荧光测定一般在较低浓度下进行。(www.xing528.com)

值得注意的是，荧光法测定的是光强度，其灵敏度取决于检测器的灵敏度。即只要改进光电倍增管和放大系统，使极微弱的荧光也能检测到，就可以测定很稀溶液的浓度，灵敏度很高。而紫外-可见分光光度法测定的是吸光度A，它是透光率T的计算值，即使将信号放大，由于透射光与入射光的强度都放大，比值仍然不变，对提高测灵敏度不产生影响，所以紫外-可见分光光度法没有荧光法灵敏度高。

2.定量分析法

荧光法最主要的用途是荧光物质的定量分析，测定方法与紫外-可见分光光度法基本相同，区别是荧光法测定的是光强度，紫外-可见分光光度法测定的是透光率。

（1）工作曲线法

从已知量的标准物质经过和待测样品相同的处理后，配成有一定浓度梯度的系列标准溶液，在相同的条件下测定标准系列溶液和样品溶液的荧光强度，以标准系列的荧光强度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制F-c标准曲线图，依据测定样品的荧光强度Fx，在标准曲线上查找相应的浓度值cx，或者依据F=Kc（K为标准曲线的斜率）关系式求得浓度值cx，最后根据样品配制过程中是否有稀释的情况，换算成测定溶液的浓度值，即为测定结果。

在测定标准系列时，常采用系列中的某一个作为基础，将空白溶液的荧光强度读数调至0%，将该标准溶液的荧光强度读数调至100%或50%，然后测定标准系列中其它各个标准溶液的荧光强度。在实际工作中，当仪器调零后，先测定空白溶液的荧光强度，然后测定标准系列的荧光强度，将标准系列荧光强度减去空白荧光强度，获得标准系列真实的荧光强度，据此绘制工作曲线。这就使在不同时间所绘制的工作曲线能先后一致，在每次绘制工作曲线时均采用同一标准溶液对仪器进行校正。

如果试样溶液在紫外光照射下不太稳定，则须改用另一种稳定而荧光峰与试样相类似的标准溶液作为基准。例如在测定维生素B1时，采用硫酸奎宁作为基准。

（2）比例法

比例法是工作曲线法的最简单形式，因为荧光物质的标准曲线必须通过原点，才能选择该方法。比例法为：取已知量的纯净荧光物质配制一标准溶液，使其浓度在线性范围之内，测定荧光强度Fs，然后在相同条件下测定样品溶液荧光强度Fx和空白溶液荧光强度F0（如果调不到0%时），然后计算。

则

如果仪器以空白溶液调零时，可调至0%，即F0=0，式（3-9）可简化为理想情况，即

（3）多组分荧光物质分析

在荧光分析中，也可以像分光光度法一样，从混合物中不经过分离就可以测定被测组分的含量。如果混合物中各组分荧光峰相距较远，相互之间无显著干扰，则可分别在不同波长下测定各组分的荧光强度，从而直接求出个组分的浓度。如果各组分的荧光光谱相互重叠，则可利用荧光强度的加合性，在适宜的某几个波长处，分别测定混合物的荧光强度，以及各组分在适宜波长处的最大荧光强度，列出联立方程式，解方程组可求得各组分的含量。

对于高浓度荧光物质，一则稀释后测定；二则可采用示差荧光法测定，方法同紫外-可见分光光度法的示差法。