一、目的要求
1.了解细菌的芽孢染色原理。
2.掌握细菌的芽孢染色方法。
二、基本原理
芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，如果用一般的染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据细菌的芽孢和营养细胞对染料的亲和力不同，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而便于区别。芽孢虽难以染色，但是，芽孢一旦染上色后又难以脱色，因此，所有芽孢染色法都是基于这个原则设计的。先用着色力强的染色剂（如孔雀绿或石炭酸复红），在加热条件下进行染色，使菌体和芽孢均着色，再用水冲洗，则菌体已脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱。然后，用另一种与初染色剂对比度大的复染剂（如沙黄或美蓝）染色后，芽孢仍保留初染色剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
三、材料与仪器
（1）菌种 枯草芽孢杆菌（培养24～48h营养琼脂斜面培养物，菌龄以大部分芽孢仍保留在菌体内为宜）。
（2）染色液和试剂 5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、香柏油、二甲苯、生理盐水。
（3）仪器和用具 普通光学显微镜、接种环、酒精灯、火柴、载玻片、木夹、小试管、烧杯等。
四、方法与步骤
（一）常规的舍夫勒—富尔顿（Schaeffer—Fulton）氏染色法
1.涂片
取洁净的载玻片1块，加1滴生理盐水，用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌在水滴中涂成均匀的薄膜，涂抹直径约为1cm。
2.晾干固定
将涂片放在空气中晾干后，让涂面朝上，将涂片在酒精灯火焰中以钟摆的速度来回移动3～4次，涂片温度以手背触及涂片背面微烫手为宜（不超过60℃）。
3.孔雀绿染液染色
在涂面上滴加孔雀绿水溶液3～5滴（染料以铺满涂片为度），用木夹夹住载玻片一端，在酒精灯上微火加热至染液冒蒸汽时开始计时5min。注意：染液需产生蒸汽但不沸腾；加热过程中随时补加染液保持涂片不干。
4.脱色
待载玻片冷却后，倾去染液，斜置玻片，用自来水从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。脱色时，水流不要直接冲在涂面处，水流不宜过急、过大，以免涂面薄膜脱落。
5.复染
将番红水溶液1～2滴加到涂面上，以染液刚好覆盖涂面为宜，染色1～2min。
6.水洗、干燥
倾去染液，斜置玻片，用自来水从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。然后晾干或用滤纸吸干。
7.镜检
先用低倍物镜找到物像，再用油镜观察。(www.xing528.com)
结果：芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈红色。
（二）改良的Schaeffer—Fulton氏染色法
1.制备菌悬液
取1～2滴生理盐水于小试管中，用接种环挑取枯草芽孢杆菌斜面培养物2～3环于试管中搅拌均匀，制成浓稠的菌悬液。
2.孔雀绿染液染色
滴加2～3滴孔雀绿水溶液于已接菌的小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液混合均匀。
3.加热
将染色后的菌液试管置于沸水浴的烧杯中，加热15～20min。
4.涂片
用接种环从试管底部取菌液数环于洁净的载玻片上，涂成薄膜，晾干。
5.固定
让涂面朝上，将涂片在酒精灯火焰中以钟摆的速度来回移动3～4次，涂片温度以手背触及涂片背面微烫手为宜（不超过60℃）。
6.脱色
斜置玻片，用自来水从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。脱色时，水流不要直接冲在涂面处，水流不宜过急、过大，以免涂面薄膜脱落。
7.复染
将番红水溶液1～2滴加到涂面上，以染液刚好覆盖涂面为宜，染色2～3min。倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
8.镜检
先用低倍物镜找到物像，再用油镜观察。
结果：芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈红色。
五、结果报告
绘出你所观察到的枯草芽孢杆菌的形态图，并注明芽孢及菌体。
六、复习思考题
1.用一般染色法能否观察到芽孢？
2.芽孢染色用的菌种为什么要控制菌龄？
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