实验方法：采集霉菌样品的分子生物学技术鉴定

1.2.1　霉菌的采样、培养和分离纯化

在无菌操作室，用接种针在纸币上有霉菌的地方采样，使孢子附着在接种针上，用画线法将孢子接种到PDA平板培养基上。将接种完的培养皿置于培养箱中，在28℃条件下培养7天，得到霉菌试样。样品1和样品2上采集的霉菌试样分别命名为S1和S2。根据培养基上的菌落形态和颜色差异分析，S1霉菌试样中有4种菌株，分别命名为S1（a），S1（b），S1（c），S1（d）；S2霉菌试样中有2种菌株，分别命名为S2（a），S2（b）。

挑取单菌落，对霉菌试样进行分离纯化。分别挑取各平板上菌落边缘的菌接种于新的培养基上进行分离培养，培养7天后，再次根据菌落的形态及菌落边缘的整齐情况、湿润程度等现象，挑取出单菌落，重复纯化3次，最终成为单菌落。

1.2.2　霉菌的形态学观察

将分离纯化的霉菌做插片培养，用LEICA DM4000 M型显微镜观察霉菌的形态特征。

S1（a）霉菌显微镜观察结果见图5a。显微镜视野内的菌丝厚绒状，黑色，中央部分略带黄褐色，分生孢子头球形，分生孢子直径约4μm，孢子呈成串球状，它与黑曲霉的形态特征相似。S1（b）霉菌显微形貌观察结果见图5b。菌落绒状，灰黑色至黑色，分生孢子梗较短，分隔，分生孢子壁砖状，具3～5个横隔，褐黑色，常十数个成链，它与链格孢属形态特征相似。S1（c）霉菌显微形貌观察结果见图5c。菌丝在基物表面或内部匍匐，分隔，菌丝绒状或絮状，橄榄色，分生孢子梗几乎是直立且分支，分生孢子球形或卵形，构成链状分枝，分枝甚繁，它与枝孢属形态特征相似。S1（d）霉菌显微形貌观察结果见图5d。在PDA培养基上菌落呈白色绒毛状，菌丝生长速度慢，菌丝生长蓬松，多为气生菌丝，菌丝在显微镜下观察无隔，有些呈螺旋状扭结，菌丝直径3—5μm。S2（a）霉菌显微形貌观察结果见图5e。它在培养基上生长缓慢，边缘整齐或有细小缺裂，菌丝致密，表面由内向外依次为白、淡褐色、淡青色，背面淡黄褐色绒毛样菌落，菌落表面可见辐射状沟纹，分生孢子结构较多而细，孢子直径5μm左右。S2（b）霉菌显微形貌观察结果见图5f。它在培养基上生长快，菌落初期为白色，气生菌丝发达，蓬松至毡状，后因产生大量的无性孢子团而呈浅黄至金黄色，菌落反面为奶油色，中心略淡棕色。

总之，从霉变纸币样品中分离纯化得到真菌6株，通过菌落形态观察发现其生长情况有较大的差异，属于不同的类别。6株菌均能产生大量的孢子，这表明，霉变纸币上霉菌生存能力很强。

图5　六株霉菌在PDA培养基上的显微图像

1.2.3　霉菌的分子生物学技术鉴定

分子生物学技术鉴定主要流程包括霉菌基因组DNA的提取、ITS区PCR扩增、序列测定和系统发育分析等。(www.xing528.com)

采用植物基因组DNA提取试剂盒法进行霉菌DNA的提取。PCR扩增得到的DNA模板用真菌核糖体DNA转录间隔区（ITS）通用引物（ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增。PCR反应均在50μL标准反应体系中进行，PCR反应体系（50μL）：ITS4 1μL，ITS5 1μL，Taq DNA polymerase 1μL，10×Taq buffer 5μL，dNTPs 1μL，DNA模板3μL，ddH2O 38μL。PCR循环过程：95℃预变性3min，95℃变性2min，56℃退火35s，72℃延伸1min，重复变形到延伸过程34个循环，72℃延伸10min。

扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测提取到的DNA纯度。

PCR产物送去公司测序，测序结果在NCBI网站“blastn”从GenBank数据库检出与所测序列同源性较高的序列，结果见表1。

表1　6株分离株的18Sr DNA序列同源性分析

续表

在GenBank核苷酸数据库中挑选出同源性最高的序列，利用ClustalX软件分别对6株菌株序列与同源序列进行比对，然后用MEGA6.0软件构建Neighbor-Joining分子系统进化树，并进行1000次Bootstrap统计学检验，结果见图6。

图6　基于18Sr DNA序列的6株菌株系统发育树（n-j tree）