一、任务目标
（1）了解柠檬酸发酵、提取的原理及过程。
（2）熟悉和掌握摇瓶种子制备方法，掌握柠檬酸液体发酵及相关参数分析方法。
二、材料器具
1. 材料及试剂
菌种：黑曲霉（实验室分离并保存）。
黑曲霉种子培养基：20%玉米粉糖化过滤液。
发酵培养基：20%葡萄糖溶液与玉米糖化过滤液按5∶1混合。
2. 试剂
高温淀粉酶，葡萄糖，0.1429mol/L NaOH，轻质碳酸钙（200目），高锰酸钾，硫酸，活性炭，阳离子树脂，95%乙醇，1%酚酞试剂，DNS试剂，碘指示剂，草酸铵结晶紫液。
3. 主要仪器设备
80目筛子，电子天平，灭菌锅，水浴锅，超净工作台，恒温培养箱，摇床，离心机，pH计，分光光度计，显微镜，碱式滴定管，大烧杯，500mL三角瓶等若干。
三、任务实施
1.20%玉米水解糖液制备
将玉米粉用80目筛子筛好备用，按自来水：玉米粉为4：1（质量比）配制20%的淀粉乳，混匀。调pH 6.5，加入氯化钙（对固形物0.2%），加入液化酶（加酶量按20U/g），边加热边搅拌，待加热到72℃，保温10min，再加热到90℃后，恒温水解30min。碘反应呈棕红色，液化结束。迅速将料液pH调至4.2～4.5，同时迅速降温至60℃，加入糖化酶（加酶量按200U/g），60℃保温数小时后。用无水酒精检验无糊精存在时，将料液pH调至4.8～5.0，并加热至80℃，保温20min，然后将料液降至60～70℃，用双层纱布过滤，即得到20%玉米水解糖液。
2. 摇瓶种子制备
将20%玉米水解过滤液分装至500mL三角瓶中，装量为50mL，121℃，灭菌15～20min。
待培养基温度降至40℃以下时，将活化的黑曲霉孢子接入培养基中，在33～36℃，200r/min的摇床培养20h左右。菌球致密，直径不应超过0.1mm、菌丝短且粗壮、分支少、瘤状、部分膨胀为优。
3. 摇瓶发酵
取20%玉米水解糖液，按0.3%～0.35%比例加入硫酸铵，然后分装至500mL三角瓶中，装量为50mL，121℃，灭菌20min。待培养基温度降至40℃以下，接入摇瓶种子2mL（或三角瓶麸曲制备的孢子悬液，孢子浓度为106～108个/mL），24h前于转速100r/min，24h后于转速200～300r/min的摇床上，32℃连续培养3～4d。
4. 发酵罐发酵
把20%玉米水解糖液3000mL装入5L的发酵罐中，加入0.3%～0.35%的硫酸铵，pH调至4.0。封罐，灭菌30min。冷却至35℃，在无菌条件下，接入摇瓶种子或一个三角瓶麸曲制备的孢子悬液。发酵条件：32℃，初始pH 4.0，转速200r/min，通风量：发酵0～18h为0.1vvm，发酵18～30h为0.15vvm，发酵30h以后为0.25vvm。一般发酵5～6d结束，当发酵液滴定酸度不再上升，残糖在0.2%～0.5%时立即放罐。
5. 提取精制
（1）发酵液预处理 收集成熟的发酵液倒入一个大烧杯中，加热至80℃，保温处理10～20min，趁热离心，除去菌体、蛋白质、酶及孢子等杂质。
（2）碳酸钙中和 称取一定量的碳酸钙粉末（每100g一水柠檬酸需要加入71.43g碳酸钙，过量的碳酸钙会造成胶体等其它杂质的沉淀而影响质量），边搅拌边缓慢地加入预处理的发酵液中（防止产生大量的泡沫），继续加热到90℃，反应30min，柠檬酸呈钙盐析出。趁热抽滤，并用沸水洗涤沉淀物2～3次（除去残糖、蛋白质等可溶性杂质）。残糖检查方法：可用l%～2%高锰酸钾1滴加到洗涤水中，3min内不变色，说明糖分已洗净。
中和终点的控制可用pH法或用NaOH滴定法。 pH法以4.4～4.8为宜。
（3）硫酸酸解 在沉淀物中加入约2倍体积的蒸馏水，搅成糊状，调匀，然后加热至85℃，在不断搅拌下，缓慢加入一定量的0.1mol/L硫酸溶液，用量为碳酸钙的85%～90%（pH 1.8），当加入足够量的硫酸时，柠檬酸就会游离出来。反应10min，使硫酸钙结晶成熟，3000r/min离心10min，收集上层清液。
（4）脱色和去除各种阳离子用1%的颗粒活性炭（GH-11）进行脱色，然后用阳离子树脂（732型）去除各种阳离子（当出口液的pH≤3时开始收集，流速为5mL/min；当出口液的pH＞3时，收集结束），最后用阴离子树脂（D354 ）去除阴离子（当出口液的pH≤2时开始收集，流速为5mL/min；当出口液的pH＞3时，收集结束），得收集液。
（5）浓缩和结晶将收集液转入圆底烧瓶中，水浴60～70℃，真空度0.08～0.09MPa，浓缩至原体积约1/10；将浓缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4℃冰箱冷却结晶约15min，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重。
四、项目检测
（1）pH、溶解氧的跟踪测定（从二次仪表中直接读取）。
（2）黑曲霉菌丝形态观察，每隔12h镜检黑曲霉菌丝的形态变化。
（3）酸解终点的确定。
（4）发酵过程中还原糖、总酸、柠檬酸浓度的测定。
（5）计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：柠檬酸（g）/发酵液（L）。
五、发酵过程检测方法
（1）黑曲霉镜检
方法一：直接取一滴发酵液于载玻片上，用盖玻片密封后镜检。(www.xing528.com)
方法二：镜检过程：
（2）酸解终点的确定采用双管法，见附一。
（3）还原糖、柠檬酸浓度的测定分别见附二、附三。
六、结果统计
发酵过程相关参数变化情况填写下表
七、注意事项
（1）装入摇瓶的培养基不能太多，否则培养过程中黑曲霉所需要的氧气不充分。
（2）发酵过程中不能断氧，否则发酵失败。
（3）在形成柠檬酸钙沉淀及硫酸钙沉淀时应趁热离心（二者在80～90℃时溶解度极低，可与其他物质分离）。
八、任务考核
（1）镜检及菌丝形态的描述。（20分）
（2）酸解终点的确定，所需碳酸钙量计算无差错。（20分）
（3）发酵液的总酸、还原糖和柠檬酸含量测定结果。（40分）
（4）提取操作熟练准确。（20分）
附一：酸解终点的确定-双管法
取过滤后的酸解液1mL，平分为两个管，其中，一管加入1mL 20%的硫酸，另一管加入1mL 20%的氯化钙，加热至沸。如果两管均不浑浊，再分别加入1mL 95%的乙醇，若仍不浑浊，即为酸解合格。
附二：发酵液还原糖测定
1.1%葡萄糖标准溶液
准确称取100mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至100mL，冰箱保存备用。
2. 葡萄糖标准曲线的制作
取9只干燥试管编号，分别按照下表项目的顺序加入各种试剂和操作。各管内溶液混匀，用空白管溶液调零，540nm测定光密度（OD），以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标绘制葡萄糖溶液标准曲线。
3. 发酵液残留还原糖的测定
取一定体积的发酵液离心或用单层滤纸过滤去除菌体。准确量取5mL发酵上清液（视含糖量高低而定，在发酵周期内不同时期取样数量应有所不同）于100mL容量瓶中，用碱液（NaOH 3mol/L）调节至中性或碱性（pH7～9），以水稀释至刻度、摇匀。取4只干燥试管编号，按照下表的项目顺序加入相应试剂进行反应。540nm测定光密度值，以1、2、3光密度值的平均值根据葡萄糖标准曲线算出发酵液所含还原糖的量。
注意：DNS法测还原糖受柠檬酸发酵液中酸碱性的影响程度大，所以在用DNS法测pH较低的发酵液中的还原糖时，必须先将待测液pH调到中性或偏碱性。
附三：柠檬酸浓度的测定
采用醋酸酐-吡啶法测定柠檬酸含量（适用于发酵液），其原理：柠檬酸在乙酸酐存在下与吡啶生成黄色，在420nm波长下比色测定。
1. 绘制标准曲线
精确称取柠檬酸（A.R.）1g，溶解后在容量瓶中定容至1000mL，即浓度为1mg/mL。使用时再将其稀释成50，100，150，200，250，300，350，400，450，500mg/L的标准溶液。分别吸取不同浓度的标准液1mL，加入乙酸酐5.7mL、吡啶1.3mL。立即塞上塞子摇匀，放入22～29℃恒温水浴中保温30min，再立即取出，用分光光度计在420nm波长下比色。将记录的数据绘制成标准曲线。
2. 发酵液柠檬酸浓度的测定
把发酵醪液稀释适当倍数（柠檬酸含量应在200～400mg/L），然后取1mL加乙酸酐5.7mL，吡啶1.3mL，后续操作与前述标准样测定相同。最后从标准曲线上查出柠檬酸含量。
3. 计算
4. 注意事项
（1）此法是测定柠檬酸根的，但酒石酸、衣康酸、异柠檬酸的存在会直接影响显色，反丁烯二酸、丙酮酸、L-苹果酸的存在也有干扰。
（2）本反应的时间性强，与吡啶生成的黄色会随时间的延长而加深，所以必须严格控制时间。如果来不及测定。应将样品置于冰浴中终止反应。
（3）乙酸酐和吡啶易挥发，测定时，加入试剂后立即塞上塞子，整个操作越快越好。
（4）本法对温度要求严格，不同温度下显色情况不同，应加以控制。
项目拓展（十一）
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