双载体固定化红曲发酵的红曲色素生产优化

一、任务目标

（1）掌握用双载体固定化红曲细胞的制备及摇瓶发酵方法。

（2）了解红曲发酵液的色素测定原理和方法。

二、操作原理

红曲为专性好氧丝状真菌，菌丝发达，深层发酵时，易形成菌丝团，引起氧气及其他营养物质的传递困难，从而导致色素产率低于传统固态发酵。固定化红曲的发酵培养生产红曲色素具有菌体密度高、反应速率快、稳定性好、使用寿命长、可重复利用、便于产物分离等优点。

本任务采用玉米芯为吸附载体、海藻酸钠为包埋剂对红曲霉细胞进行吸附包埋固定化，菌体得以吸附在玉米芯颗粒的表面及内部，再经海藻酸钠薄层包埋，使菌体得以支撑而利于生长和代谢活动，同时复合载体固定化细胞的机械强度大，从而提高了固定化细胞的使用寿命。本任务采用摇瓶发酵方法。

三、材料器具

1. 材料

（1）菌种斜面红曲霉（Monascus purpureus）。

（2） 3mm球形玉米芯， 4% CaCl₂溶液， 5%的海藻酸钠溶液， 75%乙醇。

（3）斜面培养基（%，浓度均为质量分数）可溶性淀粉3，葡萄糖6，蛋白胨，琼脂3，pH 5.5～6.0。

（4）增殖培养基（%，浓度均为质量分数）可溶性淀粉3，NaNO₃0.3，KH₂PO₄0.15，MgSO₄·7H₂O 0.10，黄豆饼粉0.5，pH 5.5～6.0。

（5）发酵培养基（%，浓度均为质量分数）：大米粉5，NaNO₃ 0.2，KH₂ PO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O 0.10，pH 5.5～6.0。

2. 主要仪器设备

粉碎机，250mL三角瓶，烧杯，容量瓶，量筒，离心机，天平，高压灭菌锅，恒温培养箱，摇床培养箱，分光光度计。

四、任务实施

1. 红曲霉孢子的固定化

将30℃培养的斜面红曲用无菌蒸馏水制备菌悬液，使孢子浓度为6×10⁶个/L。于无菌条件下，将10mL红曲霉孢子液与10g粉磨成直径为3mm球形玉米芯混合浸泡10min，然后与15mL浓度5%的海藻酸钠溶液混浸，再倾入至100mL含4%CaCl₂溶液中，制成直径为3～4mm的颗粒，固化2h，滤出凝胶粒。用无菌水洗涤2～3次后，取1g固定化细胞颗粒转入装有50mL增殖培养基的250mL三角瓶中培养48h。(www.xing528.com)

2. 固定化细胞发酵

把增殖培养的固定化细胞转入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于旋转摇床培养150r/min，30℃下发酵72h。然后过滤得固定化细胞颗粒，重复发酵5批次。

3. 残糖的测定

用费林氏快速测定法。

4. 发酵液中色素色价的测定

（1）醇溶性色素的测定 准确吸取1mL发酵液于试管中，加入75%乙醇9mL，振荡提取1h后3000r/min离心5min，取上清液5mL于试管中，用同一乙醇溶液适当稀释。稀释液用分光光度计测OD₄₂₀和OD₅₂₀ ，以70%乙醇溶液作空白对照。

（2）水溶性色素的测定发酵液经纱布过滤，将滤液3000r/min离心5min，取上清液5mL于试管中，加水稀释。稀释液用分光光度计测OD₄₂₀和OD₅₂₀。

色价（U/mL） =（OD₄₂₀+OD₅₂₀）×稀释倍数

五、结果记录

固定化红曲细胞颗粒重复发酵产色素情况：

六、任务考核

（1）红曲霉孢子的固定化操作规范、熟练、完整。（30分）

（2）固定化细胞摇瓶发酵条件控制合理。（10分）

（3）固定化细胞气升式反应器发酵条件控制合理。（20分）

（4）残糖的测定正确、数据可靠。（20分）

（5）发酵液中色素色价的测定正确、数据可靠。（20分）

项目拓展（十）