生物源拮抗物质的提取及应用方法

拮抗菌B-FS01为本室分离。指示菌为烟草赤星病菌［Alternaria alternata（Fries）Keissler］。此外，还需要小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）。

培养病原真菌用PDA培养基。培养拮抗菌B-FS01用NA或NB培养基。

阴离子交换层析介质DEAE52，以及凝胶层析介质SupHadexG-100，均为Whatman分装，产自江苏科威技术服务公司。Tris（三羟甲基氨基甲烷）为上海伯奥生物科技公司进口分装。甘氨酸产自上海市化学工业学校试验工厂。考马斯亮蓝R-250为AMRESCO分装。SDS（十二烷基硫酸钠）产自上海伯奥生物科技公司，为美国进口分装。Acr（丙烯酰胺）产自天津市化学试剂研究所。Bis（甲叉双丙烯酰胺）产自Fluka。过硫酸铵（AP）由上海东懿试剂公司经销进口分装。四甲基乙二胺（TEMED）产自北京兴福精细化学研究所。琼脂粉产自中国医药集团上海化学试剂公司（BR）。牛血清蛋白（第五部分）为AMRESCO SIGMA进口分装，来自华美生物工程公司。分子量标准蛋白质（兔磷酸化酶B，Rabbit Phosphorylase b，97.4kD；牛血清白蛋白，Bovine Serum Albumin，66.2kD；兔肌动蛋白，Rabbit Actin，43.0kD；牛碳酸酐酶，Bovine Carbonic Anhydrase，31.0kD；胰蛋白酶抑制剂，Trypsin Inhibitor，20.1kD；鸡蛋清溶血酶，Hen Egg White Lysozyme，14.4kD）购自南京生物工程公司。蛋白酶K为AMRESCO进口分装。胃蛋白酶为AMRESCO进口分装。

垂直平板电泳槽、电泳仪、微量进样器（50uL）、层析管（φ2.5cm×30cm；φ1.6cm×80cm）、铁架台、紫外分光光度计（UV755B）、刻度试管、钟表、高压灭菌锅、酸度计、显微镜、恒温水箱、循环水式真空泵，以及高速离心机（BECKMAN F0650）。

（1）抗菌蛋白粗提液及上清液的制备

拮抗菌B-FS01接种于NA培养基中，在30℃下振荡（120r/min）培养36h后，以10000r/min离心5min去菌体，加（NH4）2SO4于上清液至70％饱和度，冰箱内4℃下静置过夜，以12000r/min离心25min收集沉淀，溶于少量的0.2mol/L NaH2PO4—Na2HPO4缓冲液中（pH＝6.5），置透析袋（截留分子量8.0kDa）中，用相同缓冲液透析去盐，即得到抗菌蛋白粗提液。收集离心后去蛋白的液体即上清液。

（2）拮抗菌B-FS01菌体的发酵液、无菌滤液、抗菌蛋白粗提液、去蛋白上清液活性测定

以烟草赤星病菌为指示菌，待平板上烟草赤星病菌菌落直径达到2cm时，将B-FS01菌体的发酵液、无菌滤液、抗菌蛋白粗提液、去蛋白上清液，在距离菌落边缘1cm处，采用对峙打孔法^[70]，用灭菌的打孔器（φ6mm）在平板上对峙打孔。每孔用枪加入30uL待测液，然后把平板置于25℃下培养，观察抑菌圈的大小，记录结果。

离心后的发酵上清液→最佳硫酸铵饱和度确立→70％硫酸铵饱和度盐析→透析、浓缩粗蛋白液→粗蛋白的FPLC分析→DEAE52纤维素柱层析→Sephadex G-100柱层析→PEG20000浓缩后透析→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。具体如下：

（1）提取拮抗蛋白最佳硫酸铵饱和度的确立

B-FS01菌株经NB培养液在30℃下振荡（120r/min）培养48h后，用高速离心机（10000r/min）离心5min去菌体。在去菌液中加入30％饱和度的硫酸铵（用磁棒搅拌，硫酸铵固体分批加入），在冰箱4℃下静置过夜后，以12000r/min离心25min，得到粗蛋白（沉淀部分）。将其溶于20mmol/L NaH2PO4—Na2HPO4缓冲液中（pH＝6.5），置透析袋（截留分子量8.0kD）中，用同缓冲液透析去盐，即得到抗菌蛋白粗提液。按上述方法分别在经30％硫酸铵沉淀过的上清液中依次加入45％，60％，70％，90％饱和度的硫酸铵，分别制得不同饱和度的拮抗蛋白粗提液，稀释至相同的蛋白浓度，以烟草赤星病菌［Alternaria alternata（Fries）Keissler］为指示菌，用对峙打孔法测不同硫酸铵饱和度的拮抗蛋白粗提液的活性，记录抑菌圈大小，比较抑菌效果，确立最适合饱和度。

（2）不连续体系聚丙烯酰胺凝胶电泳^[71]

①制胶

采用垂直电泳槽，先把玻璃板固定好，再用1％琼脂封住两端和底部。

a．分离胶制备

取一个干净的小烧杯，按着分离胶缓冲液、分离胶储液、蒸馏水1∶2∶4的比例（V/V）分别取2，4，8mL配制好，放入抽滤瓶中，用循环水式真空泵抽气10min，接着加入与分离胶缓冲液相同体积（2mL）的过硫酸铵溶液，轻轻混合，迅速用加样枪加到封好的玻璃板内，距上端后玻璃板1.5cm时，停止加液。用加样枪加入0.5cm高的蒸馏水，把胶面压平，静置30min。为了促进胶的聚合，也可把制好胶的电泳槽放入35℃的干燥箱中，等看出界面时，胶已聚合。

b．浓缩胶的制备

除去分离胶面上的蒸馏水，再在上面灌浓缩胶溶液。此溶液由浓缩胶缓冲液、浓缩胶储液、过硫酸铵溶液和40％蔗糖溶液按照1∶2∶1∶4的比例混合，分别加入1，2，1，4mL轻轻混合，用枪沿玻璃内缘迅速加入，加满为止，迅速插上1mm厚的加样梳，置日光灯下催化聚合，待浓缩胶成乳白色即可。

②点样

轻轻拔出加样梳，用滤纸吸去残留水分，用微量进样器按照从右到左的顺序每孔加入20μL样液。每个样液重复一次，加入70％饱和度提取的拮抗蛋白溶液。

③电泳

点样完成后，往电泳槽的上、下槽中倒入已稀释10倍的电极缓冲液。往上槽中滴一滴0.5％溴酚蓝指示剂。上槽接电源负极，下槽接电源正极，打开电源开关，电压260V，电流13mA，恒压电泳3h后，溴酚蓝迁移至下槽1cm处，停止电泳。取胶。

④固定、染色、脱色(www.xing528.com)

把取下的胶放入盛有染色液的白磁盘中染色20min，倒去染色液，不断变换脱色液，一直到把胶的蓝色脱去为止。

⑤检测

用凝胶成像系统观察各样液的条带。

（3）样品的FPLC分析

将70％硫酸铵饱和度提取的粗蛋白样品100μL进样到FPLC仪Superose 12凝胶过滤柱中（HR10/30，Amersham Pharmacia Biotech，St．Albans，UK），用0.1mol/L醋酸钠缓冲液（pH＝5.0）和0.1mol/L氯化钠平衡柱子，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为280nm。

（4）DEAE52纤维素柱层析

将DEAE52纤维素经常规处理后装柱（φ2.5cm×40cm），用磷酸缓冲液（20mmol/L，pH＝8.0）平衡，将上述70％硫酸铵饱和度提取的粗蛋白样品取3mL上样，用同种缓冲液洗脱，流速为18mL/h，收集活性组分（用刻度试管收集，每管3mL），进行活性检测，并收集活性组分，以便下一步进行Sephadex G-100柱层析。

（5）蛋白质的Sephadex G-100柱层析

将Sephadex G-100按常规处理后装柱（φ2.5cm×80cm），用磷酸缓冲液平衡（20mmol/L，pH值为6.8），将适量的拮抗蛋白粗提液上样后，用同缓冲液洗脱，流速为18mL/h，进行活性检测，并收集活性组分，以便下一步进行电泳检测。

（6）不连续体系SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）^[72]，^[73]

（1）拮抗蛋白浓度的测定

采用考马斯亮蓝法，参照文献^[74]。

（2）拮抗蛋白对温度敏感性试验

参照文献^[75]。30℃～90℃的敏感性试验在恒温水箱内进行，100℃的试验在水浴条件下进行，120℃的试验在高压灭菌锅内进行，作用时间均为30min，以烟草赤星病菌为指示菌，用对峙打孔法测定活性。

（3）对酸度的敏感性试验

把拮抗蛋白液（100μg/mL）的pH值分别调至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0，11.0，12.0，以烟草赤星病菌为指示菌，用对峙打孔法测定活性。

（4）对蛋白酶的敏感性

参照文献^[76]。将拮抗蛋白液（100μg/mL）分别与蛋白酶K、胃蛋白酶在最适酶促条件下反应5h后，以10000r/min离心5min，检测上清液的拮抗活性，以拮抗蛋白粗提液（不加酶）、蛋白酶K、胃蛋白酶做对照，观察抑菌圈的大小。

（5）拮抗蛋白（100μg/mL）抑制孢子萌发试验

参照文献^[77]。用绿豆汤培养基接种小麦赤霉菌菌丝后，在25℃下振荡培养7d，取10μL孢子悬液与10μL拮抗蛋白混合，采用凹玻片悬滴法置于纱布保湿的培养皿中，室温培养，定时镜检，对照为10μL孢子悬液加10μL无菌水。

（6）拮抗蛋白（100μg/mL）对菌丝的作用

挑取PDA斜面培养好的小麦赤霉菌菌丝，置于凹玻片上，加入20μL拮抗蛋白液，以无菌水为对照，培养于纱布保湿的培养皿中，室温培养，定时镜检。