酶联免疫吸附测定法：抗原和抗体的高效催化结合技术

三、酶联免疫吸附测定法

病毒与许多大分子物质（如蛋白质）一样，是一种较好的抗原，让其注射到动物体后会产生特异性抗体，抗体存在于血清之中，故称抗血清。不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。抗血清鉴定法的主要理论依据是：抗原能与其对应的抗体发生特异性反应，产生抗原－抗体复合物，通过复合物沉淀反应作出病毒鉴定。常用的抗血清法主要有酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immuno-sorbent assay，EL ISA）、免疫电镜技术检测法（immuno-electron microscopy，IEM）、直接组织免疫杂交分析检测法（direct tissue blot immunoas-say，DTBIA），其中的酶联免疫吸附测定法是新近发展起来的，是目前应用较多的一种血清学检测技术。

酶联免疫吸附测定法把抗原与抗体的特异性免疫反应与酶的高效催化作用有机结合起来，通过酶的放大作用提高抗血清鉴定的灵敏度，其测定的对象可以是抗原也可以是抗体。该法采用抗原与抗体的特异性反应将待测物与酶连接，然后再通过酶与底物产生的颜色反应作出定性或定量判断。酶联免疫吸附测定法中三种试剂必不可少：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）；②酶标记的抗原或抗体（酶标物）；③酶作用的底物（显色剂）。植物病毒酶联免疫吸附测定法基本原理是通过酶与抗体结合，制成酶标抗体，将病毒抗原吸附在固相支持物（通常采用以聚苯乙烯为原料的多孔微量板）表面，通过抗体与吸附的抗原特异性结合和酶催化底物水解生成有色产物，观察（借助光学显微镜、电子显微镜观察或肉眼观察）颜色反应差异或用酶标仪测定一定浓度波长下的吸光值判断是否含有病毒。目前，用于植物病毒检测的酶联免疫测定方法较多，常用的主要有双抗体夹心法和和A蛋白酶联免疫吸附法。

（一）双抗体夹心法（double antibody sandw ich ELISA，DAS-ELISA）

双抗体夹心法是一种直接酶联免疫测定法，此法通常适用于大分子抗原检测。该法先用病毒特异性抗体（IgG）包被微板孔，形成固相抗体；然后加入待测样品粗提物（抗原），使包被的抗体捕捉样品中的病毒粒子，形成固相抗体－抗原复合物；接着再加入酶标抗体，生成抗体－待测抗原－酶标抗体复合物；最后加入酶底物溶液进行酶催化反应，室温避光放置一定时间后，根据发生的颜色反应程度进行待测抗原的定性或定量分析判断。

(www.xing528.com)

图6-5　双抗体夹心酶联免疫测定法流程

（二）A蛋白酶联免疫吸附法（protein Asand wich ELISA，PAS-ELISA）

A蛋白酶联免疫吸附法是一种间接酶联免疫测定法，此法常用于抗体的检测。该法先用A蛋白包被微板孔，然后加入病毒抗体，接着加入待测样品粗提物，经第二层抗体与病毒结合，再加入酶标A蛋白，最后加入底物进行酶催化反应，室温避光放置一定时间后，根据发生的颜色反应程度判断结果。

温馨提示

酶联免疫吸附测定法根据所采用的酶标抗体不同，可分为直接法和间接法。直接法所用的酶标抗体为病毒特异抗体，通常需要针对不同的抗体进行分别标记；间接法所用的酶标抗体为通用的市售抗体，一般无需对每一抗体进行标记。