基因制取方法简介：限制性内切酶酶切和S1核酸酶处理

一、目的基因制取

基因克隆的第一步获得目的基因。原核细胞基因组比较简单，其基因定位相对容易，一般可直接分离基因组DNA，酶切后，以相应控针调取目的基因。真核细胞基因组相对复杂，多含有庞大数目的基因，其基因定位困难，所以，真核基因的克隆多要通过构建基因文库进行。

1.从细胞核中直接分离

简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

2.染色体DNA的限制性内切酶酶解

Ⅱ型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。若载体DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化，或靶DNA与载体DNA末端具有互补的黏性末端，可以直接进行连接。

限制性内切酶（简称限制酶，见本章第二节）可以把一个DNA分子切割成若干片段，获取目的基因。已知每种限制酶都有自己特定的作用位点，例如大肠杆菌ECORⅠ限制酶，可以把DNA中的G↓AATTC序列在G与A之间切开，它的互补链则切成CAATT↓G。切开后的两端各留一个尾巴，这两个尾巴的序列是互补的，在适当的条件下，两端通过连接酶的作用再连接在一起。在进行基因工程操作时，用限制酶把一条DNA长链切成许多片段，所需的基因即目的基因就存在于某些特定片段之中，这些片段的混合物就可作为进一步进行基因克隆的材料。

基因工程技术常用的连接酶主要有大肠杆菌DNA连接酶和T₄DNA连接酶（见本章第二节）。连接酶的作用发生在双链DNA的切口处而不能连接两条单链或DNA中缺失了核苷酸的缺口，只有当3′—OH和5′—P彼此相邻时，连接酶才能在两者之间形成磷酸二酯键，以共价链连接。以上两种DNA连接酶对限制酶切割后产生的互补黏性末端的连接作用十分有效。但是，大肠杆菌DNA连接酶不能催化平末端DNA片段的连接，而T₄DNA连接酶则能够催化。所以，这样的酶学重组子的筛选鉴定大为方便简化。

3.人工体外合成(www.xing528.com)

简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。根据基因表达产物的氨基酸顺序，搞清楚基因的核苷酸序列，然后先合成一个个含少量核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补关系使它们形成双链DNA片段，再用连接酶把小的双链DNA片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整基因。这种方法专一性非常强，基因合成效率大大提高。但这种方法目前仅限于合成核苷酸对较少的一些简单基因，而且事先要把它们的核苷酸序列搞清楚。这种合成基因的方法还有一个很大的优点，就是可以人工合成自然界不存在的新基因。

4.用逆转录酶制备cDNA

大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA（反转录DNA）得到。从RNA入手，先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid，polyA）尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12～18个dT的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成第一条。

真核生物基因组DNA十分庞大，其相应分子质量比mRNA大100倍，而且含有大量重复序列和不表达基因的内含子，因此，从基因文库中筛选出没有编码的所需基因并非易事。反转录合成法可用于合成分子量较大而又不知其序列的基因（见第二节反转录酶）。例如，家兔和人的球蛋白基因的获得是以Poly A的mRNA为模板，通过反转录的作用，合成带Poly T的cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下，以cDNA为模板合成双链的DNA。最后用S1核酸酶把Poly T切除，变成一个完整的球蛋白基因。

5.从基因文库中获取

要鉴定DNA文库中的一个特殊克隆，可以通过克隆的序列和其表达产物的结构功能来进行。前者可用于任何类型的文库、基因组或cDNA，它包括核酸杂交和PCR。无论哪种情况，探针或引物的设计都可用于一个特殊的克隆或者一系列结构相关的克隆。PCR筛选也可用于从未克隆的基因组DNA和cDNA中分离DNA序列。对克隆产物的筛选仅用于表达文库，例如DNA片段可用于表达一个蛋白质的文库。在此情况下，克隆可得到鉴定，因为其产物可由一些自然的抗体或配基来确定，或者因为保持了蛋白质的生物活性，而可由适当的检验系统来检测。

筛选目的克隆最常用的方法是探针杂交法。任意的两条单链核酸分子都有可能通过碱基配对结合，大部分的配对分子是不稳定的，因为只有少量的碱基配对。然而如果两条链是互补的，大部分碱基可以配对形成稳定的分子。不仅DNA间可以配对，DNA与RNA间也可以进行配对。因此可以使用同源探针筛选目的克隆。如果克隆的基因所编码的蛋白已知，就可以利用遗传密码子预测相关基因的核苷酸序列，只有蛋氨酸和色氨酸无兼并密码，其他的氨基酸至少有两种密码子。例如丙氨酸有四种密码子，前两位是相同的，GCA，GCT，GCC，GCG，只能正确预测两位碱基。

6.PCR技术扩增

如果知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与引物互补的引物，就可以十分有效地扩增出所需的目的基因。模板可以是基因组DNA，也可以是mRNA序列，或是已克隆到某一载体上的基因片段。

与直接分离获得目的基因相比，采用PCR分离目的基因省时、省力，但它一般要求待扩增的片段是已知的，至少要求DNA片段两端长约20bp的序列是已知的，这样才能设计出有效的引物。但利用常规的PCR合成的片段一般在1kb以内。