烟草中硝酸盐的测定方法

硝酸盐是烟草中一类重要的含氮化合物，其含量的多少不但影响烟叶的品质，还直接影响着烟气中氮氧化物和亚硝酸甲酯的含量，是Hoffman名单中的一种有害成分。硝酸盐与烟草中的植物碱可形成致癌性的烟草特有亚硝胺。

烟草种植过程中，土壤中硝酸盐含量对烟草中硝酸盐含量影响很大。下部烟叶比上部烟叶硝酸盐含量高；在一片烟叶中，叶尖含量最小，烟梗主叶脉含量最高；白肋烟中硝酸盐含量最高，香料烟次之，烤烟中含量最低。采收和初烤过程，对硝酸盐含量影响不大，而晾晒调制过程中，硝酸盐含量有明显降低。

一、方法概述

目前，关于烟草中硝酸盐含量的分析方法有多种，主要有：催化光度法、离子色谱法、分光光度法等。硝酸盐的连续流动分析采用催化剂将硝酸盐还原为亚硝酸盐后，发生重氮化-偶联反应生成红色偶氮物质。

2000年，戴亚等用1%的醋酸溶液提取烟丝中的硝酸盐，然后用锌粉在一定的pH下将硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸和α-萘胺发生重氮化-偶联反应，生产红色偶氮物质，在540nm下用分光光度计予以测定。2001年，刘万峰等在弱碱性条件下用热水萃取烟叶样品中的硝酸盐和亚硝酸盐，提取液分为两份，一份直接加入磺胺和萘乙二胺盐酸盐在538nm处测定亚硝酸盐含量，一份用金属镉将硝酸盐还原为亚硝酸盐，显色后测量样品中原有的亚硝酸盐和还原生成的亚硝酸盐总量，两者之差计算硝酸盐含量。这些方法缺点是前处理麻烦，显色的红色偶氮物质在强光高温下易分解，因而测定时不能长时间暴露在空气中。2007年，杨俊等采用在线脱色还原流动注射光度法测定烟草中硝酸盐，前处理简单、分析快速准确，避免了生成的红色偶氮物质长时间在空气中暴露。该方法采用浓度为1%的醋酸溶液振荡提取烟叶样品，过滤后用NH₄ Cl-EDTA溶液定容，然后用流动注射光度法测定，反应原理为串联的活性炭柱和镉柱在线脱色并还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与显色剂对氨基苯磺酸发生重氮化反应，再与α-萘胺发生偶合反应，生成红色的偶氮物质，在540nm处检测得到硝酸盐的含量。

国际标准ISO 15517：2003 《Tobacco—Determination of nitrate content—continuous-flow analysis method》用水萃取试样，萃取液中的硝酸盐在碱性条件下与硫酸肼-硫酸铜溶液反应生成亚硝酸盐。亚硝酸盐与对氨基苯磺酰胺反应生成重氮化合物，在酸性条件下，重氮化合物与N-（1-萘基）-乙二胺二盐酸发生偶合反应生成一种紫红色配合物，其最大吸收波长为520nm。烟草行业标准YC/T 296—2009 《烟草及烟草制品 硝酸盐的测定 连续流动法》根据该标准起草，仅存在少量技术性差异。本节重点介绍该方法。

二、方法原理

烟草中的硝酸盐在催化剂的作用下被还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与对氨基苯磺酰胺在酸性条件下发生重氮化反应，重氮化产物与芳香胺N-（1-萘基）-乙二胺发生偶合反应，生成呈紫红色的偶氮物质，在波长520nm处进行比色检测。

三、材料与方法

除非特殊说明，所有试剂应为分析纯或同等纯度。水应为去离子水或同等纯度的水。

（一）试剂

测定烟草中硝酸盐含量所需要的试剂见表3-20。

表3-20 测定烟草中硝酸盐含量所需试剂列表

1. 试剂配制

（1）Brij-35溶液（聚乙氧月桂醚）称取250g Brij-35，加入到1000mL水中，加热、搅拌直到溶解。

（2）氢氧化钠溶液（NaOH）称取8.0g NaOH，溶于800mL水中，搅拌溶解，放置冷却后转移至1000mL容量瓶中用蒸馏水定容。加入1mL Brij-35溶液。

（3）硫酸铜储备液（CuSO₄·5H₂O）称取1.20g CuSO₄·5H₂O，溶于80mL水中，搅拌溶解后转移至100mL容量瓶中用去离子水定容。

（4）对氨基苯磺酰胺（C₆ H₈ N₂O₂ S）溶液 移取25mL浓磷酸，加入到约175mL水中，然后加入2.5g对氨基苯磺酰胺和0.125gN-（1-萘基）-乙二胺二盐酸（C₁₂H₁₄N₂·2HCl），搅拌溶解，放置冷却后转移至250mL容量瓶中，用去离子水定容。过滤。储存于棕色瓶中，该溶液每两天配制一次（溶液应近无色，若呈粉红色说明有亚硝酸根干扰，应重新配制）。

（5）硫酸肼-硫酸铜试剂 将适宜硫酸肼溶于800mL水中，搅拌溶解后转移至100mL棕色容量瓶中，加入1.5mL硫酸铜储备液，用去离子水定容。该溶液每月配制一次。

注：安装调试仪器后，或购买新的硫酸肼时要进行硫酸肼溶液最佳浓度的选择，方法见本节附录。

2. 硝酸钾标准溶液（KNO₃）

（1）标准储备液 称取KNO₃ 3.3g （精确至0.0001g），溶于800mL水中，搅拌溶解后转移至1000mL棕色容量瓶中，用去离子水定容。此溶液硝酸根离子浓度约2 mg/mL。储存于冰箱中，该储备液每月配制一次。

（2）系列工作标准溶液 用储备液配制至少5个标准溶液，其浓度范围应覆盖待测样品的可能浓度范围。例如，每毫升溶液含有10～200μg的硝酸盐离子，计算出每个标准溶液的浓度，储存于冰箱中，该溶液每两周配制一次。工作标准溶液配制所使用溶液应与样品萃取液保持一致。

（二）仪器

常用实验仪器如下。

（1）连续流动分析仪，由进样器、比例泵、渗析器、加热槽、混合圈、比色计（配520nm滤光片）和记录仪组成。

（2）分析天平，感量0.0001 g。

（3）振荡器。

（三）实验方法

称取0.25g（精确至0.0001g）烟末，置于50mL具塞锥形瓶中，加入25mL去离子水（或5%醋酸溶液），盖上塞子，室温下在振荡器上振荡萃取30min。用定性滤纸过滤，弃去前几毫升滤液。收集后续滤液作分析之用。

上机运行工作标准液和样品液（管路图见图3-12）。如果样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释。

图3-12 硝酸盐测定管路图

四、结果的计算与表述

1. 硝酸盐计算(www.xing528.com)

a表示以干重计的硝酸盐含量，数值以%表示，由式（3-7）得出：

式中 c——样品液硝酸盐的仪器观测值，mg/mL；

v——萃取液体积（通常25mL），mL；

m——样品质量，mg；

w——样品水的质量分数，%。

2. 结果的表述

以两次测定的平均值作为测定结果，结果保留2位小数。两次平行测定结果绝对值之差不应大于0.05%。

注1：当用5%醋酸作萃取溶剂时，硝酸盐标准溶液亦需用5%醋酸溶液配制，进样器清洗液也应使用5%醋酸溶液。

注2：如果本方法与水溶性糖测定的连续流动法同时使用时，可配制混合标准溶液。

附录 硫酸肼溶液最佳浓度的选择

此项工作在安装调试仪器后，或在购买新的硫酸肼试剂时进行。

方法A：

A.1 亚销酸盐标准溶液

A.1.1 储备液

称取0.900g亚销酸钠（NaNO₂），溶于1000mL水中，每毫升溶液含亚销酸根离子0.6 mg。

A.1.2 工作溶液

移取25mL储备液（A.1.1），用水定容至100mL，每毫升溶液中含亚销酸根离子150μg。

A.2 硫酸肼溶液最佳浓度的选择

A.2.1 移取0.75mL硫酸铜储备液，用水定容至1000mL。

A.2.2 称取0.5 g硫酸肼，溶于100mL水中。

A.2.3 移取1.0mL、2.0mL、3.0mL、……、10.0mL硫酸肼溶液分别定容至25mL。这些溶液浓度为：每1000mL含有0.2g，0.4g，0.6g，……， 2.0 g硫酸肼。

A.2.4把硫酸肼/硫酸铜试剂线路连接到进样针上，水的线路放入硫酸铜溶液储液瓶。样品的线路放入亚销酸钠标准工作溶液储液瓶（A.1.2）。

A.2.5 打开蠕动泵，用正常方式运行试剂。

A.2.6把硫酸肼溶液（A.2.3）倒入样品杯中，按浓度由小到大的顺序放到进样器上。

A.2.7 当反应颜色到达流动池时，调节记录仪响应至满刻度的90%，开始进样。

A.2.8 当所有硫酸肼溶液进样完毕后，记下由于亚销酸根离子被还原为氮，而使溶液颜色变浅的硫酸肼溶液的浓度（C1）。

A.2.9 配制浓度为150μg/mL的销酸盐溶液，代替亚销酸盐工作溶液（A.1.2）。基线回零后，将硫酸肼溶液重新进样，记录下销酸盐响应值最大时硫酸肼溶液浓度（C2）。

A.2.10 硫酸肼溶液最佳浓度C，C2＜C＜C1。

保证销酸根离子完全还原为亚销酸根离子，而亚销酸离子不被还原为氮。

方法B：

B.1 配制相同浓度的亚销酸盐溶液和销酸盐溶液。

B.2 同时运行亚销酸盐溶液和销酸盐溶液，如果后者的响应值比前者低很多，增加硫酸肼溶液的浓度重新进样，直到两者响应值相等。