食品中着色剂测定方法大全

《食品中合成着色剂的测定》（GB/T 5009.35—2003）规定了食品中合成着色剂的测定方法。

（一）高效液相色谱法测定食用合成着色剂

1.原理

食品中的人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。

2.适用范围

高效液相色谱法适用于清凉饮料、配制酒、糖、果汁等食品中酸性人工合成着色剂的测定。

3.试剂

（1）柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸，加水至100mL，溶解混匀。

（2）甲醇甲酸（6+4）溶液：量取甲醇60mL、甲酸40mL，混匀。

（3）无水乙醇-氨水-水（7+2+1）：量取无水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL，混匀。

（4）氨水-乙酸铵溶液（0.02mol/L）：量取氨水0.5mL，加乙酸铵溶液（0.02mol/L）至1000mL，混匀。

（5）三正辛胺正丁醇溶液（5%）：量取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL，混匀。

（6）pH值为6的水：水加柠檬酸溶液调pH值到6。

（7）合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置于100mL容量瓶中，加pH值为6水到刻度，配成水溶液（1.00mg/mL）。

（8）合成着色剂标准使用液：临用时将（7）溶液加水稀释20倍，经0.4μm滤膜过滤，配成每毫升相当于50.0μg的合成着色剂。

（9）2g/L硫酸钠溶液。

（10）饱和硫酸钠溶液。

4.仪器

高效液相色谱仪：配紫外检测器。

5.操作方法

（1）样品处理。

①橘子汁、果味水、果子露汽水等：称取20.0～40.0g样品，放入100mL烧杯中。含二氧化碳样品加热驱除二氧化碳。

②配制酒类：称取20.0～40.0g样品，放入100mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。

③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取5.00～10.00g样品，粉碎样品，放入100mL小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若样品溶液的pH值较高，用柠檬酸溶液调pH值到6左右。

④巧克力豆及着色糖衣制品：称取5.00～10.00g样品，放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，到巧克力豆无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液。

（2）色素提取。

①聚酰胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH值到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少量水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融分液漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3～5次，然后用甲醇-甲酸混合液洗涤3～5次（含赤藓红的样品用液-液分配法），再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL。收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。经滤膜（0.45μm）过滤，取10μL注入高效液相色谱仪。

②液-液分配法（适用于含赤藓红的样品）：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、10～20mL三正辛胺正丁醇溶液（5%），振摇提取，分取有机相，重复提取至有机相无色。合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放入蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL，合并氨水溶液层（含水溶性酸性色素），用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调至中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。经滤膜（0.45μm）过滤，取10μL注入高效液相色谱仪。

（3）高效液相色谱仪参考条件。

①柱：YWG-C1810μm不锈钢柱4.6mm（id）×250mm。

②流动相：甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液（pH=4）。

③梯度洗脱：甲醇，20%～35%，3%/min；35%～98%，9%/min；98%继续6min。

④流速：1mL/min。

⑤紫外检测器：254nm波长。

（4）测定取相同体积液和合成着色剂标准液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

6.结果计算

样品中着色剂的含量按下式进行计算。

式中：X——试样中着色剂的含量，g/kg；

A——试样中着色剂的质量，μg；

V1——进样的体积，mL；

V2——试样稀释的总体积，mL；

m——试样的质量，g。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数与。(www.xing528.com)

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（二）纸色谱法测定食品中的水溶性着色剂

1.原理

水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法进行分离后，与标准比较定性及定量。

最低检出量为50μg/kg，点样量为1g，样品最低检出浓度约为50mg/kg。

2.适用范围

纸色谱法适用于食品中酸性水溶性人工合成色素的测定。

3.试剂

（1）展开剂：正丁醇-无水乙醇-氨水（1%）：6+2+3；正丁醇-吡啶-氨水（1%）：6+3+4；甲乙酮-丙酮-水：7+3+3。

（2）柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸，加水至100mL，溶解混匀。

（3）pH值为6的水：水加柠檬酸溶液调pH值到6。

（4）合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置于100mL容量瓶中，加pH值为6的水到刻度，分别配成水溶液（1.00mg/mL）。

（5）合成着色剂标准使用液：临用时吸取色素标准溶液各5.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH值为6的水到刻度，分别配成水溶液（0.10mg/mL）。

（6）甲醇-甲酸（6+4）溶液：量取甲醇60mL、甲酸40mL，混匀。

（7）乙醇-氨水溶液：取氨水1mL，加70%乙醇至100mL。

4.仪器

（1）可见分光光度计。

（2）滤纸：中性滤纸，纸色谱用。

（3）层析缸。

5.操作方法

（1）样品处理。

①果味水、果子露、汽水：称取50.0g样品于100mL烧杯中，汽水需加热驱除二氧化碳。

②配制酒：称取100.0g样品于100mL烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。

③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖：称取5.00g或10.0g粉碎均匀的样品，加30mL水，温热溶解，若样液pH值较高，用柠檬酸溶液（200g/L）调pH值到4左右。

④奶糖：称取10.0g粉碎均匀的样品，加30mL乙醇-氨溶液溶解，置水浴上浓缩至20mL，立即用硫酸溶液（1+10）调至微酸性，再加1.0mL硫酸（1+10），加1mL钨酸钠溶液（100g/L），使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。

⑤蛋糕类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀，用热风吹干用品，加入30mL石油醚搅拌。放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理三次，以除去脂肪，吹干后研细，全部倒入G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇-氨溶液提取色素，直至着色剂全部提完，以下操作按奶糖处理方法进行。

（2）吸附分离。将处理后所得的溶液加热到70℃，加入1g聚酰胺粉充分摇匀，用柠檬酸溶液（200g/L）调pH=4，使着色剂完全被吸附。若溶液还有颜色，可再加一些聚酰胺粉。将吸附着色剂的聚酰胺粉全部转入漏斗中过滤，用pH=4的70℃的水反复洗涤，每次20mL，边洗边搅拌。若含有天然着色剂，再用甲酸-甲醇溶液洗涤1～3次，每次20mL至溶液无色为止，再用70℃的水多次洗涤至流出液为中性，洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分3次解吸全部着色剂，收集全部解吸液于水浴上除氨。如果为单色，用水稀释至50mL，用分光光度法测定；如果为多色，用纸色谱法分离后测定，将上述溶液置于水浴上浓缩至2mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇（50%）洗涤容器，洗液转移入容量瓶中并稀释至刻度5mL。

（3）定性。取色谱用纸，在距底边2cm起始线上分别点3～10μL样品溶液、1～2μL着色剂标准液于分别盛有正丁醇-无水乙醇-氨（1%）和正丁醇吡啶-氨水（1%）展开剂的层析缸中，用上行洗展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤液取出，于空气中晾干，与标准斑比较定性。

也可取0.5mL样液在起始线上从左至右点成条状，纸的左边点着色剂标准液，依次展开，晾干后定性。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用甲乙酮-丙酮-水做展开剂。

（4）定量。

①将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移于10mL比色管中，并加水稀释至刻度，做比色测定用。

②标准曲线绘制：分别吸取0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用溶液，或0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL亮蓝、靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。上述试样与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下（胭脂红510nm、苋菜红520nm、柠檬黄430nm、日落黄482nm、亮蓝627nm、靛蓝620nm）测定吸光度，绘制标准曲线。

6.结果计算

样品中着色剂的含量按下式进行计算。

式中：X——试样中着色剂的含量，g/kg；

A——试样中着色剂的质量，mg；

V1——试样解吸后的总体积，mL；

V2——样液点纸的体积，mL；

m——试样的质量，g。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。