测定食品中的黄曲霉毒素

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉在合适的温度、湿度条件下产生的真菌毒素，在自然界中广泛存在，是所有真菌毒素中对环境污染最严重，对人畜危害最大且毒性最强的真菌次级代谢产物。黄曲霉毒素由15～20种结构和组成相近的化合物构成，目前已分离出十余种存在形式，但自然存在的最常见的形式是AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂，其毒性是氰化钾的10倍，是砒霜的68倍。其中，以AFB₁的危害性和毒性为最强，能引起人类肝毒、致癌、致畸、致突变、出血、免疫失调，被国际肿瘤研究机构列为人类第一大致癌物质。鉴于其危害性很大，因此其在食品中残留量的检测具有非常重要的意义。

黄曲霉毒素的检测方法主要有液相色谱法、薄层层析法、胶体金法、酶联免疫吸附法等，现行有效的检测方法标准有《食品中黄曲霉毒素B₁的测定》（GB/T 5009.22—2003）、《食品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的测定》（GB/T 5009.23—2006）、《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M₁和B₁的测定》（GB 5009.24—2010）和《食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》（GB/T 18979—2003）。在此着重介绍GB/T 5009.23—2006中的高效液相色谱法（第三法）。

1.原理

试样经乙腈-水提取，提取液过滤后，用装有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的黄曲霉毒素以三氟乙酸衍生，用带有荧光检测器的液相色谱系统分析，用外标法定量。

2.试剂与仪器

（1）试剂

1）黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂标准品，纯度大于99%；乙腈（色谱纯、分析纯）；三氟乙酸（分析纯）；正己烷（分析纯）；水，电导率（25℃）小于或等于0.01mS/m。

2）（84+16）乙腈-水提取液：量取乙腈（分析纯）840mL，加水160mL，混匀。

3）（85+15）水-乙腈溶液：量取乙腈（分析纯）150mL，加水850mL，混匀。

4）标准储备溶液：分别准确称取0.2000g、0.0500g、0.2000g、0.0500g（精确至0.001g）黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂置于10mL容量瓶中，加乙腈（分析纯）溶解，并稀释至刻度。此溶液密封后避光-30℃保存，两年有效。

5）标准工作液：准确移取标准储备液1.00μL，置于10mL容量瓶中，加乙腈（分析纯）稀释至刻度。此溶液密封后于4℃避光保存，三个月有效。

6）标准系列溶液：准确移取标准工作液适量，置于10mL容量瓶中，加乙腈（分析纯）稀释至刻度（含黄曲霉毒素B₁、G₁的质量浓度分别为0.00μg/L、0.5000μg/L、1.000μg/L、2.000μg/L、5.000μg/L、10.00μg/L、25.00μg/L、50.00μg/L、100.0μg/L；含黄曲霉毒素B₂、G₂的质量浓度分别为0.00μg/L、0.1250μg/L、0.2500μg/L、0.5000μg/L、1.250μg/L、2.500μg/L、6.250μg/L、12.50μg/L、25.00μg/L），注意避光。

（2）仪器 高效液相色谱仪（附荧光检测器）、色谱柱（反相C₁₈柱，要求4种毒素的峰能够达到基线分离）、电动振荡器、旋涡混合器、烘干箱、离心机、真空吹干机或氮气及水浴锅、天平（感量为0.0001g）。

3.试样的提取

称取20g充分粉碎过的试样，置于250mL锥形瓶中，加入80mL（84+16）乙腈-水提取液，在电动振荡器上振荡30min后，用定性滤纸过滤，收集滤液。

4.试样的净化

移取约8mL提取液至多功能净化柱的玻璃管内，将多功能净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管，将净化液收集到多功能净化柱的收集池中。

5.试样的衍生化

从多功能净化柱的收集池内转移2mL净化液到棕色具塞小瓶中，在真空吹干机下于60℃±1℃吹干（或在60℃水浴下用氮气吹干，注意不要使液体鼓泡、飞溅），加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，密闭混匀30s后，在40℃±1℃烘干箱内衍生15min，然后于室温用真空吹干机吹干（室温水浴下氮气吹干），以200μL（85+15）水-乙腈溶液溶解，混匀30s，以1000r/min的转速离心15min，取上清液置于液相色谱仪的样品瓶中，供测定用。

6.标准系列溶液的制备

吸取标准系列溶液各200μL，在真空吹干机下于60℃吹干（或在60℃水浴下用氮气吹干，注意不要使液体鼓泡、飞溅），衍生化方法同试样的衍生化。(www.xing528.com)

7.测定

（1）色谱条件

1）色谱柱：C₁₈柱，长度为12.5cm，内径为2.1mm，粒度为5μm。

2）柱温：30℃。

3）流动相：乙腈（色谱纯），水，梯度变化见表7-7-3。调整洗脱梯度，使4种黄曲霉毒素的保留时间为4～25min。

表7-7-3 流动相的梯度变化

4）流速：0.5mL/min。

5）进样量：25μL。

6）荧光检测器：激发波长为360nm，发射波长为440nm。

（2）测定 黄曲霉毒素按照G₁、B₁、G₂、B₂的顺序出峰，以标准系列的峰面积对质量浓度分别绘制每种黄曲霉毒素的标准曲线。将试样与标准色谱图保留时间进行比较，确定每一种黄曲霉毒素的峰，根据每种黄曲霉毒素的标准曲线及试样中的峰面积计算试样中各种黄曲霉毒素的含量。

8.结果计算

式中 X——试样中每种黄曲霉毒素的含量（μg/kg）；

c——试样按外标法在标准曲线中对应的质量浓度（μg/L）；

V——试样提取过程中提取液的体积（mL）；

m——试样的质量（g）；

f——试样溶液衍生后较衍生前的浓缩倍数。

计算结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差不得超过算术平均值的15%。