志贺氏菌是革兰氏阴性杆菌，是细菌性痢疾的病原菌。该菌无芽孢、无荚膜、无鞭毛，多数有菌毛，兼性厌氧，能在普通培养基上生长，形成中等大小、半透明的光滑型菌落。细菌性痢疾是最常见的肠道传染病，传染源主要为病人和带菌者，通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等感染。因此，对食品加强志贺氏菌的检验，在食品卫生学上具有重要的意义。
在此依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》（GB 4789.5—2012），介绍适用于食品中志贺氏菌检验的方法。
1.原理
食品中志贺氏菌的检验主要是利用样品的志贺氏菌增菌肉汤接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板，观察菌落形态，挑取典型或可疑菌落接种后观察结果，再进行生化试验及附加生化试验鉴定到亚属，最后经血清学进行分型鉴定。
2.培养基和试剂
志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素、麦康凯（MAC）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂、志贺氏菌显色培养基、三糖铁（TSI）琼脂、营养琼脂斜面、半固体琼脂、葡萄糖铵培养基、尿素琼脂、β-半乳糖苷酶培养基、氨基酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、西蒙氏柠檬酸盐培养基、黏液酸盐培养基、蛋白胨水和靛基质试剂、志贺氏菌属诊断血清、生化鉴定试剂盒。
3.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1）恒温培养箱：36℃±1℃。
2）冰箱：2～5℃。
3）膜过滤系统。
4）厌氧培养装置：41.5℃±1℃。
5）电子天平：感量为0.1g。
6）显微镜：10～100倍。
7）均质器。
8）振荡器。
9）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
10）无菌均质杯或无菌均质袋：容量为500mL。
11）无菌培养皿：直径为90mm。
12）pH计或pH比色管或精密pH试纸。
13）全自动微生物生化鉴定系统。
4.检验程序
志贺氏菌检验程序如图7-8-7所示。
5.操作步骤
（1）增菌及分离
1）以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000～10000r/min的转速均质；或加入装有225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1～2min，液体样品振荡混匀即可，于41.5℃±1℃厌氧培养16～20h。
2）取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表7-8-9。
图7-8-7 志贺氏菌检验程序
表7-8-9 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
（2）初步生化试验
1）自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，于36℃±1℃培养20～24h，分别观察结果。
2）凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖、不发酵乳糖、蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。(www.xing528.com)
（3）生化试验及附加生化试验
1）生化试验：用初步生化试验中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性，宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌13型的β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。另外，由于福氏志贺氏菌6型的生化特性与痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。对于生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，也不得判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表7-8-10。
表7-8-10 志贺氏菌属四个群的生化特征
注：+表示阳性；-表示阴性；-/+表示多数阴性；+/-表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性；d表示有不同生化型。
①痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。
②鲍氏13型为鸟氨酸阳性。
③福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。
2）由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，因此前面生化试验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、黏液酸盐试验（于36℃培养24～48h）。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表7-8-11。
表7-8-11 志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别
注：1.+表示阳性；-表示阴性；d表示有不同生化型。
2.在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、黏液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性。
3）若选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，则可根据初步生化试验时的初步判断结果，用培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
（4）血清学鉴定
1）抗原的准备：志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻璃片凝集试验用的抗原。
当一些志贺氏菌因K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔置于1mL生理盐水中，做成浓菌液，于100℃煮沸15～60min，去除K抗原后再检查。
D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株，也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有K抗原。
2）凝集反应：在玻璃片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻璃片上每一区域的上部，在其中一个区域的下部加1滴抗血清，在另一区域的下部加入1滴生理盐水作为对照，再用无菌的接种环或接种针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻璃片倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，并且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现凝集现象，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则可挑取菌苔置于1mL生理盐水中，做成浓菌液，于100℃煮沸15～60min，去除K抗原后进行试验。
3）血清学分型（选做项目）：先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用B群福氏志贺氏菌多价血清进行试验，若出现凝集现象，则再用其群和型因子血清分别检查。如果B群多价血清不凝集，则用D群宋内氏志贺氏菌血清进行试验，当出现凝集现象时，用其Ⅰ相和Ⅱ相血清检查；如果B、D群多价血清都不凝集，则用A群痢疾志贺氏菌多价血清及1～12各型因子血清检查。如果上述三种多价血清都不凝集，则可用C群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用1～18各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表7-8-12。
表7-8-12 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别
（续）
注：+表示凝集；-表示不凝集；（）表示有或无。
6.志贺氏菌的报告
综合生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。
7.注意事项
1）志贺氏菌在常温存活期很短，因此，在样品采集后，应尽快进行检验。如果在24h内检验，可将样品保存在冰箱内。若欲保存较长的时间，必须放在低温冰箱内。
2）增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺氏菌的阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于两个。
3）动力的观察非常重要，挑取可疑菌落，除接种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂、一支营养琼脂斜面。
4）生化试验另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、黏液酸盐试验，是为了排除A-D菌以及无动力不产气的大肠埃希氏菌。应当着重注意鉴别的是无动力不产气的大肠埃希氏菌。
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