生物技术药物的生产系统优化方案

与合成药物不同，生物技术药物中的活性药物成分主要是重组蛋白和核酸。目前，绝大多数商品化的生物技术药物以重组蛋白作为其活性药物成分。这些蛋白质可以在原核系统（如大肠杆菌）中产生，也可以在基于真菌（如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母）、哺乳动物细胞、昆虫细胞的真核系统中产生。此外，还研究了使用无细胞表达系统（体外系统）来生产药物，这极大地改变了合成条件。

上述的每个系统用于生物制药都有各自的优缺点。因此，需要根据重组蛋白的特性使用合适的表达系统。

（一）哺乳动物表达系统

哺乳动物表达系统通常是制造生物技术药物的优选平台（表1-3）。近年来，人们对蛋白质分子的生产越来越感兴趣，推动了哺乳动物表达系统的使用。蛋白质需要特异性的翻译后修饰（尤其是糖基化），而这种修饰只发生在哺乳动物表达系统中。另外，在哺乳动物细胞中，大多数重组蛋白可以分泌表达，因此省去了通过裂解细胞来提取蛋白质产物的环节。

表1-3　由哺乳动物表达系统生产的一些药物及其应用

然而，在哺乳动物细胞中产生的蛋白质可能会被动物病毒污染而导致潜在的安全问题。此外，哺乳动物表达系统也有不足之处，如营养需求复杂、生长缓慢、操作技术要求高、产率低、生产成本较高等。目前可用的哺乳动物表达系统包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、啮齿类动物细胞系（如NS0、BHK和Sp2/0）和人细胞系（如HEK293、PER.C6、HT-1080和CAP）。其中，中国仓鼠卵巢细胞是重组蛋白生产的主要选择。2016年，前10种畅销的生物技术药物中有7种是在中国仓鼠卵巢细胞中生产的。总的来说，在哺乳动物表达系统中生产且被批准用作人类药物的重组蛋白产品的数量在2010—2014年间增加至生物技术药物的约60%。

（二）细菌表达系统

虽然哺乳动物表达系统在蛋白质的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，但是细菌仍然是生产重组蛋白最常用的表达系统。根据BioProcess Technology Consultants提供的数据，2010年，作为生物技术药物中活性药物成分的纯蛋白质总产量为26.4 t，其中，68%在细菌表达系统中产生，32%在哺乳动物表达系统中产生。在细菌表达系统中产生的主要蛋白质包括胰岛素，在哺乳动物表达系统中产生的蛋白质绝大多数是单克隆抗体。

表达异源蛋白质常选择大肠杆菌表达系统，大肠杆菌表达系统的优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。然而，该表达系统也存在一些局限性：不存在哺乳动物的翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化和蛋白质水解加工。因此，在生物技术工业中，大肠杆菌表达系统被选择用于大规模生产不需要翻译后修饰的小重组蛋白。此外，在大肠杆菌表达系统中蛋白质不能形成正确的二硫键，且存在溶解度和内毒素（脂多糖）等问题的限制。目前，已有几种策略被应用以改善蛋白质表达，例如使用突变的大肠杆菌菌株来促进蛋白质二硫键的形成。

大肠杆菌表达系统除了可以用于生产重组蛋白以外，还能生产一些其他类型的化合物作为药物（表1-4）。

表1-4　由大肠杆菌表达系统生产的一些药物及其应用

续表

（三）酵母表达系统(www.xing528.com)

真核微生物也是有利的微生物重组蛋白生产系统，如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。这两种宿主都能够产生具有适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。因此，对于需要翻译后修饰的靶蛋白来说，它们被认为是比原核生物更好的宿主。

酿酒酵母表达系统经常被使用，因为它们能够在无蛋白质培养基中快速生长并且能够分泌细胞外产物。然而，细胞内发生的翻译后修饰常常会产生非预期的高甘露糖基化，从而改变蛋白质的结合活性，并可能在治疗应用中产生可变的免疫应答。

在巴斯德毕赤酵母中，寡糖具有更短的链长，据报道该菌株会产生复杂的、末端唾液酸化或“人源化”的糖蛋白。巴斯德毕赤酵母可进行高密度发酵，具有强且严格调节的启动子，每升培养物可以产生克量的重组蛋白（胞内蛋白或分泌蛋白），因此，巴斯德毕赤酵母表达系统得到了很高的肯定。然而，在某些情况下，尤其是表达异源寡聚体、膜附着的或容易发生蛋白质水解而降解的复合蛋白时，蛋白质产量会显著降低。

虽然在酵母表达系统中表达的蛋白质具有糖基化修饰，但是其糖链的结构和组成与天然蛋白质差异较大，因此，对于那些糖链结构会极大地影响生物活性的蛋白质（如EPO、治疗性抗体等），仍然无法用酵母表达系统来表达。

（四）昆虫细胞表达系统

昆虫细胞表达系统又称杆状病毒表达系统，是一类应用广泛的真核表达系统，它介于细菌和哺乳动物表达系统之间。昆虫细胞表达系统具有许多优点：①具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统；②正确的蛋白质折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白质，有利于表达产物形成天然的高级结构；③具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；④昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白，蛋白质最高表达量可达昆虫细胞蛋白质总量的50%；⑤可表达非常大的外源性基因（相对分子质量约为200000）而不至于影响本身的增殖；⑥具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；⑦通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物的几乎所有的蛋白质，并且能表达带有内含子的外源基因；⑧对脊椎动物是安全的，杆状病毒属于昆虫病毒，有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而在自然界的生存能力很弱，被认为是安全的载体。

（五）转基因动物

利用转基因动物生产重组蛋白的原理是将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，以制备转基因动物，并使外源基因在动物体内（乳汁、血液等）进行高效表达，然后提取目的产物。转基因动物生产系统具有产量高、成本低、产物更接近人类蛋白质等优点。然而，动物的转基因技术也存在一些不足，如相对低效而且耗时。由于转基因的整合随机性和有限的转基因拷贝数，科学家虽然尝试了各种方法以改善转基因，但是获得成功的却很有限。

ATryn（α-antithrombin）是一种生物技术药物，于2006年在欧盟上市，2009年在美国上市。它是一种抗凝血药，用于治疗罕见的遗传性抗凝血酶缺乏症，其活性药物成分——人类α-抗凝血酶，就是在转基因山羊的乳腺中产生的。

（六）植物表达系统

作为高附加值的重组蛋白生产平台，由于在成本和安全性方面的优势，植物表达系统已成为继哺乳动物、微生物等表达系统之后，获得广泛认同的极具潜力的蛋白质表达系统。植物表达系统主要包括转基因植株、叶绿体转化植物、瞬时表达系统和细胞悬浮培养。植物表达系统的主要优点：①植物属于真核生物，可以形成具有正确结构和构象的高活性重组蛋白；②植物与动物不一样，几乎不受动物病原菌感染，产品安全性高；③植物表达的总体生产成本仅为微生物的2%～10%、动物的0.1%左右；④植物表达产品的分离纯化成本相对较低，可食性药物还可省去下游加工；⑤便于储存，植物蛋白质可以储存在特定的器官，如种子、果实等部位。

以整株植物作为生物反应器来生产重组蛋白，生产周期较长，因此不适于快速生产药物以对抗新出现的疾病。此外，现有的植物生物技术对于植物中的转基因表达水平不能一贯地精确控制。因此，作为替代方案，植物细胞培养物（如胡萝卜悬浮培养物和烟草BY-2细胞）得到了更广泛的使用。2012年，在胡萝卜根细胞中产生的蛋白质——重组人葡萄糖脑苷脂酶被允许进入药物市场。它是美国FDA批准用于临床的第一种由植物生产的生物技术药物，用于治疗罕见的遗传性疾病——戈谢病。用孤儿药治疗这种疾病费用非常昂贵（每位患者每年约花费200000美元），而使用胡萝卜根细胞生产系统将每位患者的花费降低到每年150000美元。

（七）体外表达系统

体外表达系统，又称无细胞蛋白质合成系统，是以外源DNA或mRNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。

最初，一些障碍限制了体外表达系统应用于蛋白质的生产，如蛋白质产率低、试剂成本高、反应规模小、正确折叠含有多个二硫键的蛋白质的能力有限等。目前，由于在自动化和优化反应条件方面取得了重大进展，体外表达系统成为极具吸引力的蛋白质生产平台。与其他表达系统相比，体外表达系统的主要优势：①反应体系为细胞提取物而不是活细胞，不需要细胞壁或稳态条件来维持细胞活力；②可以控制翻译环境、反应组分和反应条件；③可以生产在其他系统中难以表达的蛋白质，如膜蛋白、毒性蛋白及易受蛋白酶水解的蛋白质；④不需要基因转染、细胞培养或蛋白质纯化等步骤，也不需要任何宿主菌，操作简便；⑤可以直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质，生产效率高。

STRO-001是一种抗体-药物偶联物，靶向在B细胞恶性肿瘤中高表达的CD47。2018年10月，美国FDA授予了STRO-001用于治疗多发性骨髓瘤（MM）的孤儿药资格。自此，STRO-001成为第一个在体外表达系统中生产的生物技术药物，显示了无细胞蛋白质合成技术的商业可行性。