抗血清多克隆抗体的优化制备方案

抗血清多克隆抗体制备的主要步骤：①抗原的制备；②免疫动物的选择；③动物免疫；④效价测试；⑤血清采集；⑥抗血清的纯化和鉴定；⑦抗血清的保存。

（一）抗原的制备

为了获得具有潜在临床治疗作用的抗血清，通常选用多肽抗原、重组蛋白抗原、全细胞抗原、质粒DNA和腺病毒表达的抗原等。抗原的制备大致要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的破碎或细胞器的分离；③可溶性抗原的提取；④抗原的纯化及其含量测定、理化性质和纯度鉴定；⑤纯化抗原的浓缩或干燥、保存。

（1）天然抗原的提取与纯化：根据物理性质不同，抗原可分为颗粒性抗原和可溶性抗原。颗粒性抗原包括细胞抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、真菌抗原和各种细胞器等。对于全细胞抗原的制备，以培养细胞为例，首先要充分洗涤细胞，以排除细胞外各种可能污染的蛋白质，并为了保持细胞的完整性和活性，采用低速离心。一般采用800 r/min转速离心10 min即可。然后用PBS至少洗涤3次，重悬并计数后即可用于免疫反应。而蛋白质、多糖、脂类、脂多糖、细菌外毒素等可溶性抗原很多来源于组织细胞，通常需要将组织和细胞破碎，经一定方法纯化后才能获得所需要的抗原。

①提取：组织细胞的破碎可采用酶处理法、物理法（如反复冻融法、超声破碎法）、表面活性剂处理法等。

②分离与纯化：绝大部分天然抗原为蛋白质，不同的蛋白质可根据其沉降系数特点、溶解特性、分子大小等理化性质的不同提取后进一步分离纯化以获得抗原纯品。常用的方法有离心分离法、有机溶剂沉淀法、盐析法、超滤法、层析法、电泳法等。例如，用33%～50%的饱和硫酸铵进行盐析，是经典的蛋白质纯化分离方法，其具有简便、有效、不破坏抗原活性等优点。层析法根据其原理不同可分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。亲和层析是利用生物大分子的生物学特性，如抗原和抗体、配体和受体等之间特殊的亲和力而设计的层析分离技术，该方法的特点是特异性强、操作简单、提取物纯度高，是纯化抗原常用而有效的一种方法。

③鉴定：鉴定纯化蛋白质抗原的含量、相对分子质量、纯度以及免疫学活性。

④浓缩与保存：抗原经纯化后常需浓缩，常用方法有吸附浓缩、蒸发浓缩和超滤浓缩三种；浓缩后的抗原可在干燥状态或添加防腐剂后在液态低温保存。

（2）基因工程抗原的制备：随着基因工程技术的建立和不断完善，亦可应用基因工程技术表达特定蛋白质抗原或其片段或通过核苷酸序列推导合成相应编码的蛋白质抗原。简述以下三种制备方法。

①用cDNA文库筛选抗原编码基因：以肿瘤抗原编码基因的筛选为例，首先确定用于筛选的单克隆抗体，从表达相应抗原的肿瘤细胞中提取全部RNA→依次获得mRNA→cDNA→克隆至表达载体构建cDNA文库，然后用抗肿瘤抗原的单克隆抗体对此文库进行筛选，获得编码相应抗原的基因。

②噬菌体展示随机肽库获得抗原表位：随机肽库的构建是利用基因工程技术将随机的寡核苷酸序列按可读框与丝状噬菌体基因Ⅲ或基因Ⅷ融合，使每个噬菌体的表面展示不同的多肽片段。用一个特异性抗体去筛选噬菌体随机肽库时，可以从中获得对应该抗体的天然抗原表位的抗原模拟物。

③CTL克隆技术：以肿瘤抗原的筛选为例，首先要获得对肿瘤细胞有特异性杀伤作用的T细胞系，以识别肿瘤抗原表位。然后建立肿瘤细胞系的重组cDNA表达文库，转染表达有细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）可识别的MHC-Ⅰ类分子或Ⅱ类分子的细胞系，使肿瘤特异性杀伤T细胞与转染有肿瘤细胞cDNA的靶细胞共同孵育。通过检测Cr释放或细胞因子的分泌判断效应T细胞对靶细胞的杀伤作用。阳性的靶细胞经扩增后获得DNA，所得到的DNA经测序后进一步鉴定并最终获得CTL相关的肿瘤抗原编码基因。

获得的肿瘤抗原编码基因可克隆至基因工程表达载体，大量表达、纯化回收后用于免疫动物，也可用来与其他蛋白质或肽段连接成融合蛋白进行表达。亦可将靶抗原编码基因置于真核表达调控元件的调控下，将该质粒DNA或腺病毒DNA直接进行动物体内接种，诱导特异性体液和细胞免疫应答，此即为裸DNA免疫。

（3）合成肽抗原的制备：合成肽抗原由于长度较短被视为半抗原，与蛋白质载体连接后能有效地诱导机体产生免疫应答。

①合成肽抗原的选择：具有免疫原性的肽段的选择是关系到能否获得特异性抗体的关键。需要考虑的另一个因素是抗原和相关蛋白质及家族成员的潜在同源性。当制备功能性抗体时，可利用生物信息学先确定所针对的特异性蛋白质结构域的功能。同时借助抗原表位预测分析软件，比较准确地筛选出含抗原表位的多肽片段。备选区域通常具备以下条件：a.表面暴露，如某个亲水区域；b.相对于其余结构部分的构象柔性，如环区或预测形成β-转角的区域。

②肽的合成与纯化：多肽的自动化固相合成与纯化技术，使合成肽半抗原成为抗体制备中抗原的重要来源。

③载体选择与连接：常用载体有蛋白质、多肽聚合物和大分子聚合物。常用的载体蛋白有人血清白蛋白、牛血清白蛋白和血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用多聚赖氨酸。聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素等大分子聚合物皆可与半抗原结合，加入FCA可诱导动物产生良好的抗体。

半抗原与载体的连接方法有物理吸附法和化学法。物理吸附法的载体主要有聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素等，其原理是通过电荷和微孔吸附半抗原。化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接，主要要求是连接方法不明显改变半抗原的结构，并保留半抗原的抗原表位。

半抗原与载体结合的数目与免疫原性密切相关。一般认为，要有20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上才能有效刺激免疫动物产生抗体。因此，在合成肽抗原制备时应测定偶联到载体上的半抗原量。

（二）免疫动物的选择

可用于免疫的动物主要是哺乳类和禽类，常选用家兔、绵羊、豚鼠、马和鸡等。动物种类的选择主要依据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途。如制备抗γ-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。例如，BALB/c小鼠对抗原有较强的免疫反应并以IgG1反应为主，而相比而言，C57BL/6小鼠的免疫反应较弱，以IgG2a反应为主。因此，具体选择免疫用的动物时，应考虑以下因素。

（1）抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫原性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。如，鸡在亲缘关系中远离哺乳动物，免疫的鸡可在蛋黄中产生高浓度IgY抗体。

（2）动物个体的选择：选择适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）。

（3）抗血清的需要量：需要大量制备免疫血清时，应选用马、驴、绵羊、山羊等大型动物，如一头成年马反复采血可获得10000 mL以上血清。若需要量不多，则可选用家兔、豚鼠和鸡等小型动物。如果抗原难以获得，且抗体需要量少，还可以选用纯系小鼠。(www.xing528.com)

（4）抗原性质：不同种类的动物对同一种抗原有不同的免疫应答表现。因此，对不同性质的免疫原，所选用的动物有所不同。蛋白质抗原对大部分动物适合，常选用家兔和山羊。但在某些动物体内有类似的物质或因为其他原因，有些蛋白质抗原对这些动物免疫原性极差，如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类（如胃蛋白酶原等）对山羊等，免疫反应时皆不易产生抗体，这些物质有时可用豚鼠（如胰岛素等）、火鸡，甚至猪、狗、猫等进行免疫反应。

（三）动物免疫

机体对抗原的初次免疫应答的特点主要是低亲和力抗体和IgM，同时免疫系统产生了记忆性T细胞和B细胞。当免疫系统再次遇到相同抗原时，免疫记忆使机体产生更快和更强的免疫反应，产生亲和力更强的抗体，主要是IgG。多克隆抗体的产生利用了免疫记忆的特点从而增强了免疫应答。由此可知，高效价的抗血清的获得不仅与抗原的剂量有关，而且与免疫方法、免疫途径和免疫间隔时间等均相关。

（1）抗原的剂量：抗原剂量不合适可能引起免疫抑制、耐受或免疫反应偏移促进细胞介导免疫。抗原剂量的选择应考虑抗原的特性、使用的佐剂、物种、免疫途径、免疫时间及动物的个体状态等因素。每个抗原最好单独决定。佐剂的应用使低剂量抗原成功免疫成为可能，并且佐剂能提高抗体滴度，并减少免疫耐受产生的机会。一般而言，需要纳克（ng）到微克（μg）级的抗原加上佐剂诱导高滴度的免疫反应。例如，对于蛋白质抗原，小鼠首次剂量为50～400 pg，大鼠为0.1～1 mg，兔为0.2～1 mg；对于全细胞抗原，每次用于免疫羊的细胞数一般不低于1×108个，免疫兔不低于1×107个，免疫小鼠不低于1×106个。第一次免疫剂量宜小，随后可增大抗原剂量。

（2）免疫途径：免疫途径需要通过考虑物种、抗原特性、佐剂混合物、抗原用量、体积、何种淋巴器官被活化以及何种抗体反应类型被诱导来决定。免疫途径还需要考虑动物福利，因为佐剂可能引起疼痛和应激反应。因此没有一个通用的免疫步骤。常用的注射途径有皮内、皮下、肌内、静脉和腹腔注射。免疫时一般采用多个部位注射，不仅能增加抗原与免疫细胞接触的概率，从而可能增强机体免疫反应，还能够因为每个部位较小量的佐剂而使佐剂相关不良反应减少。

（3）免疫间隔时间：第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段，如果很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔10～20天为好。两次免疫以后每次的间隔时间一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，产生的抗体效价不高。对于半抗原的免疫间隔时间则要求更长，这是因为半抗原是小分子，难以刺激机体发生免疫反应。免疫的总次数多，多为5～8次。如为蛋白质抗原，第8次免疫若未获得合适效价的抗体，可在30～50天后再追加免疫一次；如仍不能产生抗体，则应更换动物。半抗原需更长时间的免疫才能产生高效价抗体，有时总时间为一年以上。

（4）免疫程序：免疫程序应根据设计的目的和要求、抗原性质、佐剂的种类等而制定。一般而言，如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。常规免疫方案为抗原加FCA皮下多点注射进行基础免疫，再以免疫原加FIA进行2～5次加强免疫，每次间隔时间为2～3周，经皮下或腹腔注射加强免疫。

（四）效价测试

完成免疫程序后，先取少量血清检测抗体效价。若效价不高，可加强免疫后再次采血测试效价；若达到要求则应在末次免疫后一周及时采血。

抗血清的效价是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价的测定可根据抗体的不同性质，分别采用放射免疫分析法、双向琼脂扩散法、环状沉淀反应、单向免疫扩散、溶血试验、凝集反应、酶联免疫吸附试验等方法。以兔抗变形杆菌抗体的制备为例，采用凝集反应测试效价，如果抗血清效价达到1∶2000即可采血。如果是可溶性抗原，常用双向琼脂扩散法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法。以人IgG抗体免疫家兔为例，如用双向琼脂扩散法测定效价达1∶16以上（稀释抗体），即可采血。

（五）血清采集

采血前动物应禁食24 h，以防血脂过高。常用的采血方法有颈动脉采血法、心脏采血法和静脉采血法。采血后应尽快将血清与血细胞分离。否则细胞溶解释放出的蛋白质水解酶等杂蛋白会污染抗体并将抗体水解，降低效价。

（六）抗血清的纯化和鉴定

（1）抗血清的纯化：免疫血清纯化的目的是尽量去除抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止其他血清成分对应用造成影响。因此，根据不同的目的要求，从免疫血清中除去容易干扰的有关成分，或提取相应的免疫球蛋白。

①杂抗体的去除：有亲和层析法和吸附法两种。亲和层析法是将交叉抗原交联到凝胶介质Sepharose 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲和层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是只与其特异性抗原发生反应的抗血清，称为单价特异性抗血清。吸附法是利用不含用于免疫动物的抗原而含有其他杂抗原的抗原液，如血清、组织液或已知的某种吸附剂，或含2%～3%的其他无关蛋白（如牛血清白蛋白、兔血清白蛋白等），用双功能交联剂制成固相吸附剂。置于4℃过夜后，将胶状交联产物打碎并经缓冲液多次洗涤后，成为颗粒状的凝胶吸附剂。将这种吸附剂直接加到免疫血清中（约1∶10），杂抗体被吸附结合，上清液则成为无杂抗体的单价特异性抗血清。

②IgG类抗体的纯化：可用盐析法获得较纯的IgG，也可用离子交换层析法、亲和层析法。具体参见重组蛋白的纯化相关内容。

（2）抗血清的鉴定。

①抗血清的效价鉴定：不同的抗原制备的抗血清，对效价的要求不一。颗粒性抗原可采用凝集反应，可溶性抗原常用双向琼脂扩散实验、ELISA等方法。目前更常用的是放射免疫法，以不同稀释度的抗血清与标记抗原混合，孵育一定时间后，测定结合率，通常以结合率为50%的血清稀释度为效价。

②抗血清的特异性鉴定：抗体的特异性是指其与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性越高，它的识别能力就越强。特异性可用多种方法测定，其本质都是利用抗原、抗体特异性的相互作用。可通过双向琼脂扩散法、免疫电泳等直接观察，但往往灵敏度较低。近年来出现了一些新的仪器和方法，如ELISA、放射免疫分析法、免疫荧光法、表面等离子共振和石英晶体微天平等。特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争性抑制试验测定。分别制作不同浓度的抗原和近似抗原的竞争性抑制曲线，并计算各自的结合率，求出各自的IC50，并计算交叉反应率。如果所用抗原的IC50数量级为皮克级（每毫升），而近似抗原的IC50几乎是无穷大时，表示这一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似为0，即该血清的特异性较好。

③抗血清亲和力的鉴定：测定抗体亲和力的方法较多，如平衡透析法、ELISA或放射免疫分析竞争结合试验等。

④抗体纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向琼脂扩散法、免疫电泳等方法。IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白质电泳带（相对分子质量约为53000和22000），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。

（七）抗血清的保存

抗血清的保存方法有三种。第一种方法是置于4℃保存。将抗血清除菌后，液体状态保存于普通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，1年内不会影响使用。保存时加入0.01%硫柳汞钠或0.1%叠氮钠作为防腐剂，若加入一定量的甘油则保存期可延长。第二种方法是低温保存。在-40～-20℃温度下保存5年，抗体效价不会有明显下降。切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。因此，低温保存应分装成小份。第三种方法是冷冻干燥。最后制品内水分含量不应高于0.2%，封装后可以长期保存，在10年内效价不会明显下降。