测定茶叶中霉菌和酵母菌的技能训练

1.原理

茶叶是我国传统的大宗农产品，其产量、消费量和出口量在国际上占有重要比重。在茶叶的生产和储存过程中，生产方式和环境条件的影响，使得茶叶中产生真菌。茶叶中的大量真菌，会影响茶叶的品质，给消费者的健康带来不利影响。茶叶中的真菌已列入必检项目。根据国家标准GB 4789.15—2010的规定，制作马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，使样品中的霉菌和酵母菌繁殖生成菌落，以菌落计数测定霉菌和酵母菌的数目，附加氯霉素作为抗生素，抑制细菌等微生物的生长，对茶叶中的真菌进行检测。

2.仪器与试剂

（1）仪器 冰箱（2～5℃）、恒温培养箱（28℃±1℃）、均质器、恒温振荡器、显微镜（10～100倍）、电子天平（感量为0.1g）、无菌锥形瓶（500mL，250mL）、无菌广口瓶（500mL）、无菌吸管（1mL，具0.01mL刻度；10mL，具0.1mL刻度）、无菌平皿（直径为90mm）、无菌试管（ϕ10mm×75mm）、无菌牛皮纸袋、塑料袋。

（2）试剂

1）马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基

马铃薯（去皮切块） 300g

葡萄糖 20.0g

琼脂 20.0g

氯霉素 0.1g

蒸馏水 1000mL

制法：将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10～20min，然后用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL，加入葡萄糖和琼脂，加热熔化，分装后，于121℃灭菌20min。在倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

2）孟加拉红培养基

蛋白胨 5.0g

葡萄糖 10.0g

磷酸二氢钾 1.0g

硫酸镁（无水） 0.5g

琼脂 20.0g

孟加拉红 0.033g

氯霉素 0.1g

蒸馏水 1000mL(www.xing528.com)

制法：将上述各成分加入蒸馏水中，加热熔化，补足蒸馏水至1000mL，分装后，于121℃灭菌20min。在倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

3.检验程序

霉菌和酵母菌计数的检验程序如图2-3-11所示。

4.操作步骤

（1）样品的稀释

1）称取25g样品置于盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1∶10稀释液。也可将样品放入盛有225mL无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1∶10的样品匀液。

2）取1mL1∶10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中，另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1∶100稀释液。

3）按以上操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。

图2-3-11 霉菌和酵母菌计数的检验程序

4）根据对样品污染状况的估计，选择2个或3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液置于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。

5）及时将15～20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

（2）培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，于28℃±1℃培养5天，观察并记录。

（3）菌落计数 用肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母菌数，以菌落形成单位CFU表示。

选取菌落数在10～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母菌数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板平均数。

5.结果与报告

（1）结果 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；若为原液，则以小于1计数。

（2）报告结果 菌落数在100CFU以内时，按“四舍五入”的原则修约，采用两位有效数字报告。当菌落数大于或等于100CFU时，前3位数字采用“四舍五入”的原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”的原则修约，采用两位有效数字。称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母菌数。