提取酵母蔗糖酶的方法与技巧

一、任务目标

（1）掌握细胞研磨法破碎酵母细胞的方法。

（2）学会蔗糖酶抽提及酶活力测定的原理和操作。

二、操作原理

蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）又称转化酶，能催化蔗糖水解产生葡萄糖、果糖，是一种广泛存在于自然界中的糖苷酶。目前蔗糖酶在农产品加工、食品、医药等行业中发挥重要作用。

蔗糖酶一般从酵母中提取。蔗糖酶属于胞内水解酶，提取时需对酵母细胞进行破壁处理，破壁方法主要有研磨法、酶解法、反复冻融法等，本实验采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来。蔗糖酶的耐热温度为50℃，45℃以下可保持酶活不变；在pH为3.0～8.0范围内均可保持较高的酶活。蔗糖酶的活性中心有巯基，提取时应防止其被氧化，或者加入还原剂（如维生素C）保持酶活力。

三、材料器具

1. 材料和试剂

活性干酵母，石英砂，甲苯（AR），0.5mol/L氨水，1mol/L醋酸溶液，1mol/L NaOH，DNS试剂。

2. 主要仪器设备

研钵，离心机，天平，烧杯，量筒，容量瓶，玻璃棒等。

四、任务实施

1. 制备酵母泥

取活性干酵母5g，加入100mL麦芽汁，小心混匀。静止复水、活化，每隔10min轻轻搅拌，共3次。于28℃、160r/min摇瓶培养12～15h，5000r/min离心10min，取沉淀。

2. 破碎细胞

在研钵内加入酵母泥，加5～10g石英砂，再加10mL甲苯，在研钵内研成糊状。然后加10mL水，研磨10min左右，重复2次。之后转移到离心管中，以5000r/min的转速离心15min。

3. 粗提

用吸管小心将离心后的中间水层转移到干净的离心管中，注意勿带上层甲苯相，以5000r/min的转速离心15min。将第二步离心后的上清液取出，倒入量筒中记录其体积（V₁ ），取2.0mL进行第一组分（测定组1：粗酶液）的酶活力测定。

4. 热抽提

将1mol/L醋酸溶液逐滴加入粗提液中，调其pH至5.0，然后迅速放入到45℃的水浴中，保温30min。在恒温过程中，注意经常缓慢摇动试管或搅拌抽提液。之后在冰浴中迅速冷却，以5000r/min的转速离心15min，弃去热变性杂蛋白。量出上清液体积（V₂），取2.0mL进行第二组分（测定组2：热抽提液）的酶活力测定。

五、注意事项

（1）提纯过程应在低温下操作。

（2）研磨应充分，尽量使所有的蔗糖酶都进入溶液中。(www.xing528.com)

（3）热抽提时，要选择合适的温度和加热时间，防止目的物变性。

六、结果处理

（1）将两次测定的体积记录。

（2）测定酶活力。

（3）计算蔗糖酶回收率。

七、任务考核

（1）离心、研磨等操作无差错。（40分）

（2）正确测定第一组分酶活。（30分）

（3）正确测定第二组分酶活。（30分）

附：蔗糖酶酶活的测定。

蔗糖酶作用于β-1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与DNS试剂共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。

1. 蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖

2. DNS法测定还原糖量

3. 计算酶活力

将吸光度代入下面还原糖标准曲线，得到水解液中还原糖的质量。

Y=0.67X+0.027

式中 Y——吸光度；

X——还原糖的质量，mg（蔗糖酶活力指在一定实验条件下，在规定时间内释放1mg还原糖的酶量为一个活力单位）。

（1）计算酶活力公式为

酶活力/（U/mL） =还原糖毫克数×3.5（水解液体积） /1.0（酶液体积）

（2）计算蔗糖酶回收率公式为

回收率=纯酶液活力/粗酶液活力