实验：酵母蔗糖酶的沉淀分离优化

一、任务目标

（1）掌握有机溶剂沉淀酶蛋白的方法。

（2）熟悉酶蛋白沉淀分离原理、特点、适用性以及操作方法。

二、操作原理

采用有机溶剂沉淀法提纯蔗糖酶。根据蔗糖酶的分子量和亲水性，在溶液中加入一定量的无水乙醇溶液，利用其脱水作用，破坏了蛋白质分子表面的水化膜，使蔗糖酶聚集沉淀下来，而与其他杂质分开。

三、材料器具

1. 材料

粗细胞抽提液E，无水乙醇，4mol/L乙酸。

2. 主要仪器设备

磁力搅拌器，离心机，烧杯，量筒，滴管，分液漏斗。

四、任务实施

1. 调酸

粗酶液E，用4mol/L稀乙酸调pH至4.5。

2. 沉淀除杂

32%乙醇饱和度沉淀除杂。按X₁/（V+X₁）= 0.32计算并量取所需乙醇体积X₁（V为粗酶液体积），粗酶液E（体积V mL）及所需乙醇在冰箱中预冷，把酶液置于烧杯中，放在磁力搅拌器上，在一定的搅拌下用分液漏斗缓缓滴加乙醇。滴加中，酶液渐渐浑浊，滴加完毕后，分装于离心管中平衡，于5000r/min离心10min，得到上清液，倒入另一烧杯中，待用，弃去沉淀。(www.xing528.com)

3. 沉淀蔗糖酶

47.5%（体积分数）饱和度乙醇沉淀蔗糖酶。按X₂/（V+X₂ ）=0.475计算浓度达47.5%所需的无水乙醇量，再按X₂-X₁量取需补加的无水乙醇体积。用步骤2所示的方法继续在上清液中缓缓滴加乙醇，使乙醇浓度达到47.5%，于5000r/min离心10min，弃去上清液，得少量沉淀，用60mL pH 6.0的磷酸缓冲液溶解，不溶物离心除去，得上清液即为较纯的蔗糖酶液。

五、注意事项

要注意离心操作时温度的控制。

六、结果处理

（1）量蔗糖酶液体积并准确记录。

（2）分别测定粗酶液E和沉淀蔗糖酶液酶活力。

（3）采用考马斯亮蓝法测定粗酶液E和沉淀蔗糖酶液蛋白质的含量（mg/mL），并计算比活力。

七、任务考核

（1）调酸、离心等操作无差错。（20分）

（2）蔗糖酶液体积记录的准确性。（20分）

（3）正确测定酶活力。（40分）

（4）正确计算比活力。（20分）

项目拓展（九）