血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳实验优化

一、实验目的

掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理和方法。

二、实验原理

采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维薄膜电泳。该法简单、快速、样品量少、区带清晰、灵敏度高、便于照相和保存。广泛用于血清蛋白、球蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白、类固醇、同工酶的分离与鉴定。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

未溶血的人或动物血清、镊子、玻璃板直尺和铅笔、醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）。

2.仪器

点样器、电泳仪、电泳槽。

3.试剂

（1）巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH 8.6，离子强度0.07）5000mL 13.8g巴比妥，77.25g巴比妥钠，加热溶解，冷后稀释至5000mL，置4℃保存。

（2）染色液（氨基黑10B）500mL 1.25g氨基黑，200mL水，250mL甲醇，50mL冰乙酸（可重复使用）。

（3）漂洗液1000mL 450mL 95%乙醇，50mL冰乙酸，500mL水。

（4）透明液1000mL（用前配制）300mL冰乙酸，700mL无水乙醇。

（5）0.4mol/L氢氧化钠溶液。

四、实验步骤

（1）浸泡 用镊子取醋酸纤维薄膜1张，（识别出光泽面与无光泽面，并在角上做上记号）放在缓冲液中浸泡20min。

（2）点样 取出薄膜夹在滤纸中吸取多余水分，无光面朝上铺于玻板上，将点样器在血清中蘸一下，再在薄膜一端2～3cm处轻轻地水平落下并随即提起（先在滤纸上练习）。

（3）电泳 电泳槽中倒上缓冲液，桥头铺滤纸，滤纸一端浸入缓冲液，驱除滤纸条上的气泡。薄膜样点端在负极，无光面朝下放于滤纸桥上。盖严电泳室，调节电压160V，电流强度0.4～0.7mA/cm膜宽，电泳25min。(www.xing528.com)

（4）染色 取出膜条浸于染色液10min。

（5）漂洗 取出膜条在漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止。

定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在0.4mol/L氢氧化钠液中30min，并剪取相同大小的无色带膜条做空白对照，在650nm进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3min后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。

五、结果与讨论

电泳图谱如图1-1所示。

图1-1 电泳薄膜图谱

六、注意事项

（1）点样要少、轻、直、匀。

（2）不要将薄膜吸得过干。

（3）漂洗时不要用镊子来回拉动。

（4）节约漂洗液。

思考题

1.用醋酸纤维薄膜作电泳支持物有什么优点？

2.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？

参考文献

[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.

[2]Robert H. Glew，Miriam D. Rosenthal. Clinical studies in medical biochemistry[M]. 3rd ed. Oxford University Press，2007.

[3]李巧枝，程绎南．生物化学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.