烤肉中苯并芘含量分析及影响因素探究

一、实验目的

（1）掌握致癌化合物的种类。

（2）气相色谱—质谱联用仪的原理使用技能。

（3）《食品安全国家标准 食品中苯并（a）芘的测定》（GB 5009.27-2016）。

二、实验原理

试样经过有机溶剂提取，中性氧化铝或分子印迹小柱净化，浓缩至干，用乙腈溶解，反相液相色谱分离，荧光检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

（1）熏制肉、鱼、豆制品（熏鱼、腊肉、火腿、香肠、熏豆、烤鸭等）；谷物、油脂等。

（2）中性氧化铝柱 填料粒径75～150μm，22g，60mL。

注：空气中水分对其性能影响很大，打开柱子包装后应立即使用或密闭避光保存。由于不同品牌氧化铝活性存在差异，建议对质控样品进行测试，或做加标回收试验，以验证氧化铝活性是否满足回收率要求。

（3）苯并（a）芘分子印迹小柱500mg，6mL。

注：由于不同品牌分子印迹柱质量存在差异，建议对质控样品进行测试，或做加标回收试验，以验证是否满足要求。

（4）微孔滤膜0.45μm。

2.仪器

（1）液相色谱仪 配有荧光检测器。

（2）分析天平 感量为0.01和1mg。

（3）粉碎机。

（4）组织匀浆机。

（5）离心机 转速≥4000r/min。

（6）涡旋振荡器。

（7）超声波振荡器。

（8）旋转蒸发器或氮气吹干装置。

（9）固相萃取装置。

3.试剂

（1）甲苯（C₇H₈）色谱纯。

（2）乙腈（CH₃CN）色谱纯。

（3）正己烷（C₆H₁₄）色谱纯。

（4）二氯甲烷（CH₂Cl₂）色谱纯。

（5）苯并（a）芘标准品（C₂OH₁₂，CAS号：50-32-8）：纯度≥99.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

注：苯并（a）芘是一种已知的致癌物质，测定时应特别注意安全防护！测定应在通风柜中进行并戴手套，尽量减少肢体暴露。如已污染了皮肤，应采用10%次氯酸钠水溶液浸泡和洗刷，在紫外光下观察皮肤上有无蓝紫色斑点，若有蓝紫色斑点，应一直洗到蓝色斑点消失为止。

（6）苯并（a）芘标准储备液（100μg/mL）准确称取苯并（a）芘1mg（精确到0.01mg）于10mL容量瓶中，用甲苯溶解，定容。避光保存在0～5℃的冰箱中，保存期1年。

（7）苯并（a）芘标准中间液（1.0μg/mL）吸取0.10mL苯并（a）芘标准储备液（100μg/mL），用乙腈定容到10mL。避光保存在0～5℃的冰箱中，保存期1个月。

（8）苯并（a）芘标准工作液 把苯并（a）芘标准中间液（1.0μg/mL）用乙腈稀释，得到0.5、1.0、5.0、10.0、20.0ng/mL的校准曲线溶液，临用现配。

四、实验步骤

（1）试样制备、提取及净化

①谷物及其制品

预处理：去除杂质，磨碎成均匀的样品，储于洁净的样品瓶中，并标明标记，于室温下或按产品包装要求的保存条件保存备用。

提取：称取1g（精确到0.001g）试样，加入5mL正己烷，旋涡混合0.5min，在40℃下超声提取10min，4000r/min离心5min，转移出上清液。再加入5mL正己烷重复提取一次。合并上清液，用下列2种净化方法之一进行净化。

净化方法一：采用中性氧化铝柱，用30mL正己烷活化柱子，待液面降至柱床时，关闭底部旋塞。将待净化液转移进柱子，打开旋塞，以1mL/min的速度收集净化液到茄形瓶中，再转入50mL正己烷洗脱，继续收集净化液。将净化液在40℃下旋转蒸至约1mL，转移至色谱仪进样小瓶中，在40℃氮气流下浓缩至近干。用1mL正己烷清洗茄形瓶，将洗涤液再次转移至色谱仪进样小瓶中，并浓缩至干。准确吸取1mL乙腈到色谱仪进样小瓶中，涡旋复溶0.5min，过微孔滤膜后供液相色谱测定。

净化方法二：采用苯并（a）芘分子印迹柱，依次用5mL二氯甲烷及5mL正己烷活化柱子。将待净化液转移进柱子，待液面降至柱床时，用6mL正己烷淋洗柱子，弃去流出液。用6mL二氯甲烷洗脱并收集净化液到试管中。将净化液在40℃下用氮气吹干，准确吸取1mL乙腈涡旋复溶0.5min，过微孔滤膜后供液相色谱测定。

②熏、烧、烤肉类及熏、烤水产品(www.xing528.com)

预处理：肉去骨、鱼去刺、贝去壳，把可食部分绞碎均匀，储于洁净的样品瓶中，并标明标记，于-16～-18℃冰箱中保存备用。

提取：同①中提取部分。

净化方法一：除了正己烷洗脱液体积为70mL外，其余操作同①中“净化方法一”。

净化方法二：操作同①中“净化方法二”。

③油脂及其制品

提取：称取0.4g（精确到0.001g）试样，加入5mL正己烷，旋涡混合0.5min，待净化。

注：若样品为人造黄油等含水油脂制品，则会出现乳化现象，需要4000r/min离心5min，转移出正己烷层待净化。

净化方法一：除了最后用0.4mL乙腈涡旋复溶试样外，其余操作同①中的“净化方法一”。

净化方法二：除了最后用0.4mL乙腈涡旋复溶试样外，其余操作同①中的“净化方法二”。

试样制备时，不同试样的前处理需要同时做试样空白试验。

（2）仪器参考条件

①色谱柱：C18，柱长250mm，内径6mm，粒径5μm，或性能相当者。

②流动相：乙腈+水=88∶12。

③流速：1.0mL/min。

④荧光检测器：激发波长384nm，发射波长406nm。

⑤柱温：35℃。

⑥进样量：20μL。

（3）标准曲线的制作 将标准系列工作液分别注入液相色谱中，测定相应的色谱峰，以标准系列工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到标准曲线回归方程。苯并（a）芘标准溶液的液相色谱图见图8-10。

（4）试样溶液的测定 将待测液进样测定，得到苯并（a）芘色谱峰面积。根据标准曲线回归方程计算试样溶液中苯并（a）芘的浓度。

图8-10 苯并（a）芘标准溶液的液相色谱图

五、结果与讨论

试样中苯并（a）芘的含量按式（8-35）计算：

式中 X——试样中苯并（a）芘含量，μg/kg；

ρ——由标准曲线得到的样品净化溶液浓度，ng/mL；

V——试样最终定容体积，mL；

m——试样质量，g；

1000——由ng/g换算成μg/kg的换算因子。

结果保留到小数点后一位。

精密度：在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

六、注意事项

（1）方法检出限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg。

（2）高效液相色谱分离多环芳烃的效果与洗脱液的比例、柱温和流速等有关，其最适宜的条件随仪器而异。

思考题

1.样品处理时影响3，4—苯并芘含量的因素有哪些？

2.食品中3，4—苯并芘的危害及预防措施分别是什么？

3.苯并（a）芘存在于哪些食品中？

4.苯并（a）芘的检测过程中，使用苯并（a）芘标准品需要注意什么？

5.根据你的实验结果，分析实验的影响因素，探讨实验的经验或教训。

参考文献

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局．GB 5009.27-2016 食品安全国家标准 食品中苯并（a）芘的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.