测定食品中抗生素残留量的侧定用色谱法

（一）抗生素残留量的侧定

用色谱法测定抗生素残留量是目前较为常用的检测方法。下面以肉中四环素族药物残留量的检测为例介绍食品中抗生素残留量的测定方法。

1.原理

样品经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分离，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素等。

2.仪器和试剂

（1）仪器气相色谱仪、检测器、色谱柱、振荡器。

（2）试剂。混合标准溶液：分别吸取1.0mg/mL土霉素、四环素的0.01mol/L盐酸溶液各1mL，1.0mg/mL金霉素水溶液2mL，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。此溶液每毫升含土霉素、四环素各0.1mg，金霉素0.2mg，临用时现配。

3.操作步骤

（1）样品制取。称取5.00g（±0.01g）切碎的肉样（＜5mm），置于50mL锥形瓶中，加入5%高氯酸25.0mL，于振荡器上振荡提取10min，移入离心管中，以2000r/min离心3min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，备用。

（2）色谱条件。

检测器：紫外检测器，波长为355nm，灵敏度为0.002AUFS。

色谱柱：ODS-C185μm，6.2mm×15cm。

流动相：乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（用30%硝酸溶液调节pH至2.5；35+65，体积比）。

温度：柱温为室温。

流速：1.0mL/min，进样量为10μL。

（3）工作曲线绘制。分别称取7份切碎的肉样，每份5.00g（±0.01g），分别加入混合标准溶液0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0μL（含土霉素、四环素各为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0μL），含金霉素0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0和50.0μg置于50mL锥形瓶中，加入5%高氯酸25.0mL，于振荡器上振荡提取10min，移入离心管中，以2000r/min离心3min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，取10μL滤液进样，以峰高为纵坐标，以抗生素含量为横坐标，绘制标准曲线。

4.结果计算

式中：A为样品溶液测得抗生素含量，mg；m为样品质量，g。

5.说明及注意事项

（1）四环素族抗生素是家禽、家畜常用的防病治病药物。

（2）测定肉中抗生素残留量的方法较多，目前应用较多的方法是微生物法和高效液相色谱法。

（二）己烯雌酚残留量的侧定

1.原理

样品匀浆后，经甲醇提取过滤，注入HPLC柱中，经紫外检测器于波长230nm处测定吸光度，同条件下绘制工作曲线，己烯雌酚含量与吸光度值在一定浓度范围内成正比，样品与工作曲线比较定量。

2.仪器和试剂(www.xing528.com)

（1）仪器。高效液相色谱仪（具有紫外检测器）、小型绞肉机、小型粉碎机、电动振荡机、离心机。

（2）试剂。使用的试剂一般为分析纯，有机溶剂需过0.5μm滤膜，无机试剂需过0.45μm滤膜。

①甲醇、0.043mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、磷酸。

②己烯雌酚（DES）标准储备液：精密称取100mg己烯雌酚溶于甲醇，移入100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，每毫升含DES1.0mg，储于冰箱中。

③己烯雌酚（DES）标准使用液：吸取10.00mLDES储备液，移入100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，每毫升含DES100μg。

3.操作步骤

（1）提取及净化。称取5g（±0.1g）绞碎（小于5mm）肉样品，放入50mL具塞离心管中，加10.00mL甲醇，充分搅拌，振荡20min，于3000r/min离心10min，将上清液移出，残渣中再加10.00mL甲醇，混匀后振荡20min，于3000r/min离心10min，合并上清液，此时出现浑浊，需再离心10min，取上清液过0.5μm滤膜，备用。

（2）色谱条件紫外检测器检测波长230nm。

灵敏度：0.04AUFS。

流动相：甲醇-0.043mol/L磷酸二氢钠（70/30，用磷酸调pH=5，其中NaH2PO4·2H2O水溶液需过0.45μm滤膜）。

流速：1mL/min。

进样量：20μL。

色谱柱：CLC-ODS-C18（5μm）6.2mm×150mm不锈钢柱。

柱温：室温。

（3）标准曲线的绘制。称取5份（每份5.0g）绞碎的肉样品，放入50mL具塞离心管中，分别加入不同浓度的标准液（6.0、12.0、18.0和24.0μg/mL）各1.0mL，同时做空白。其中甲醇总量为20.00mL，使其测定浓度为0.00、0.30、0.60、0.90和1.20μg/mL，混匀后振荡20min，于3000r/min离心10min，合并上清液，此时出现浑浊，需再离心10min，取上清液过0.5μm滤膜，备用。以下按④进行操作绘制标准曲线。

（4）测定。分别取样20μL，注入HPLC柱中，可测得不同浓度DES标准溶液峰高，以DES浓度对峰高绘制工作曲线，同时取样液20μL，注入HPLC柱中，测得的峰高从工作曲线中查出相应含量，Rt=8.2350。

4.结果计算

式中：X——为样品中己烯雌酚含量，mg/kg；

A——为进样体积中己烯雌酚含量，μg；

m——为样品的质量，g；

V2——为进样体积，μL；

V1——为样品甲醇提取液总体积，mL。

5.说明及注意事项

本标准适用于新鲜鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉中己烯雌酚残留量的测定，最小检出限为1.25ng（取样5g时，最小检出浓度为0.25mg/kg）。