噬菌体的溶源状态及其增殖机制

一、噬菌体的概念及其主要类型

专门侵害细菌和放线菌等原核生物的病毒称为噬菌体（phage），包括噬细菌体、噬放线菌体、噬蓝细菌体等，它广泛分布于自然界。1915年英国人Twort（陶尔特）在培养葡萄球菌时，发现菌落上出现了透明斑。用接种针接触透明斑后再接触另一菌落，被接触的部分不久又出现了透明斑。1917年法国人d′Herelle（第赫兰尔）在巴斯德研究所也观察到，向痢疾杆菌的新鲜液体培养物中加入某种污水的无细菌滤液，混浊的培养物变清了。将此澄清液再行过滤并加到另一敏感菌株的新鲜培养物中，混浊的培养物同样变清。以上现象，被称为陶尔特—第赫兰尔现象。后来证实，这种现象由噬菌体所引起。

噬菌体除其有特异性宿主外，与其他病毒并无显著区别。病毒粒子外壳有不同形状和大小，基本形态为蝌蚪形、微球形和线状3种。从结构看又可以分为6群不同的类型（见图4-2），图中，1、2、3群，蝌蚪状，都有尾部，1群具有收缩性的尾鞘，2群有长的非收缩性的尾部，3群的尾部很短，且具非收缩性。4、5两群，微球形，没有尾部，两者的区别是4群外壳顶端蛋白质衣壳粒较大，5群的衣壳粒则较小。6群为纤线形。

图4-2 噬菌体的类型

二、噬菌体的结构特点

噬菌体的化学成分主要是核酸和蛋白质，占病毒粒子重量的90%以上，其中核酸占40%～50%。噬菌体按核酸类型分有DNA噬菌体、RNA噬菌体。一般多为DNA型。核酸以单链或双链分子组成环状或线状，1、2、3三群由双链DNA组成，4、6群为DNA单链，5群为RNA单链（见图4-2）。

噬菌体的结构研究得较清楚的为T4噬菌体，T4由头部、颈部和尾部三个部分构成（见图4-3）。由于头部呈二十面体对称而尾部呈螺旋对称，所以是一种复合对称结构。头部内含核酸，头尾相接处呈现收隘部分，称为颈部或颈环。尾部由一个中空的管状体尾髓（或称尾管）和可收缩的蛋白质尾鞘所组成。尾端具有六角形的基板，上长有六个刺突，并缠绕着六根细长的尾丝。这是图4-2中1、2、3群所具有的特点。4、5两群头部呈微球形，现六角晶柱形，经过染色处理和高度放大，可观察到头部呈二十面体的结构，由蛋白质组成其外壳，内含核酸。

三、烈性噬菌体和温和噬菌体

噬菌体感染细菌后可产生两种后果：一种是噬菌体增殖而引起细菌裂解；另一种是噬菌体不增殖而使细菌建立带噬菌体基因的状态，此现象称为溶源现象或溶源性。因此，根据与宿主细胞的关系将噬菌体分为烈性噬菌体（virulent phage）和温和噬菌体（temperate phage）两类。

1.烈性噬菌体

大部分噬菌体侵入寄主细胞后，引起寄主细胞的代谢改变，在寄主细胞内复制其核酸、蛋白质，装配成新的噬菌体，最终使寄主细胞破裂而释放大量子代噬菌体，这类噬菌体称为烈性噬菌体。噬菌体的繁殖一般分为五个阶段，即吸附、侵入、增殖（复制与生物合成）、成熟（装配）、裂解（释放）。烈性噬菌体凡在短时间内能连续完成这五个阶段而实现其繁殖，其增殖过程与一般病毒相似。

图4-3 大肠杆菌T4噬菌体的模式图

1—游离的噬菌体 2—噬菌体的尾鞘收缩和尾管穿入细菌细胞

大部分噬菌体利用其尾端的尾丝吸附在宿主细胞壁的特异受体上。吸附作用受噬菌体数量、环境温度、pH、某些离子的存在等因素的影响。由于每一宿主细胞表面的特异受体有限，因此所能吸附噬菌体的数目也有一个限量。Ca²⁺、Mg²⁺和Ba²⁺等阳离子对吸附有促进作用，而Al³⁺、Fe³⁺和Cr³⁺等阳离子则可引起失活。另外在pH中性、生长最适温度范围内时有利于吸附。利用某些理化因子对吸附的促进作用和抑制作用，在发酵工业中对防止噬菌体的污染有一定的意义。

噬菌体的增殖过程很快，例如，E. coli T系噬菌体在合适的温度等条件下仅为15～20min。平均每一宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数称作裂解量（burst size），不同的噬菌体有所不同，例如T2为150左右，T4约为100。

2.温和性噬菌体

自然界还存在另一种噬菌体，吸附并侵入细胞后，噬菌体的DNA只整合在宿主的核染色体组上，并可长期随宿主DNA的复制而进行同步复制，因而在一般情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解的噬菌体，称温和噬菌体（temperate phage）或溶源噬菌体（lysogenic phage）。

带有噬菌体基因组的细菌称为溶源性细菌（Lysogenic bacterium），整合在细胞核上的噬菌体核酸称为原噬菌体（Prophage）。原噬菌体在细菌DNA上好像染色体的标记，能随细菌分裂而一代一代传下去。但这种噬菌体的溶源状态有时能自发地终止，结果导致噬菌体增殖而引起细菌裂解。用紫外线照射或烷化剂处理溶源性细菌，能显著提高原噬菌体转变为噬菌体增殖和细菌细胞裂解的发生频率。已经带有噬菌体基因的溶源细菌，可以抵抗相应的烈性噬菌体的感染。

检验溶源菌的方法是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解性循环者）相混合，然后加至琼脂培养基中倒一平板。过一段时间后溶源菌就长成菌落。由于在溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔，所以会产生一个个中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。(www.xing528.com)

四、噬菌体的检测方法

噬菌体是形体极其微小的微生物，通常在光学显微镜下不能看见，在人工培养基上又不能生长。所以，对噬菌体的检测只能采用间接的方法进行。这些方法主要是根据噬菌体的生物学特性而设计的。第一，噬菌体对寄主具有高度的特异性，可利用敏感菌株对其进行培养；第二，噬菌体侵染宿主细胞后可引起裂解，通过观察在含有敏感菌株的琼脂平板上接种噬菌体培养后是否出现噬菌斑，或是观察在含敏感菌的液体培养基中培养物是否变清来进行判断。常用的方法有载片快速检测法、单层琼脂法和双层琼脂法。

五、噬菌体与发酵工业的关系

噬菌体对发酵工业许多领域有重大危害，需要严格防止，但可应用于细菌鉴定和分类、诊断和治疗疾病、基因载体等多个方面。

（一）噬菌体污染与防止

1923年美国采用丙丁梭状杆菌（Clostridium acetobutylicum）进行丙酮、丁醇发酵时曾遭受噬菌体污染，导致工厂生产减半；1947年曾发生噬菌体感染灰色链霉菌（Streptomyces griseus），影响了链霉素的发酵。采用乳酸菌、醋酸菌、棒状杆菌等进行发酵的食品工业，生产过程中都有可能受到相应的噬菌体感染，并导致企业严重损失。

噬菌体对发酵工业的危害较大。深层液体发酵的大罐更增加了被噬菌体侵染的机会，若受噬菌体严重污染时，轻则延长发酵周期、发酵液变清和发酵产物难以形成，重则造成倒灌、停产甚至危及企业命运，这种情况在谷氨酸发酵、细菌淀粉酶或蛋白酶发酵、丙酮丁醇发酵以及各种抗生素发酵中司空见惯。

当发酵液受噬菌体严重污染时，会出现以下现象：发酵周期明显延长；碳源消耗缓慢；发酵液变清，常规镜检时，有大量异常菌体出现，用电子显微镜可观察到有无数噬菌体粒子；发酵产物的形成缓慢或根本不形成；用敏感菌做平板检测时，出现大量噬菌斑。

要防止噬菌体的危害，必须确立防重于治的观念。预防噬菌体污染的措施主要有：绝不使用可疑菌种，严格保持环境卫生，绝不任意排放和丢弃有生产菌种的菌液，注意通气质量（选用30～40m高空的空气再经严格过滤），加强发酵罐和管道的灭菌，不断筛选抗噬菌体菌种，经常轮换生产菌种以及严格会客制度等。

如果预防不成功，遭受噬菌体污染时，应及时采取合理措施。如果发现污染时发酵液中的代谢产物含量已较高，应及时提取或补加营养并接种抗噬菌体菌种后继续发酵后尽快提取产品；目前抑制噬菌体污染的药物很有限，在谷氨酸发酵中，加入草酸盐、柠檬酸铵等金属螯合剂可抑制噬菌体的吸附和侵入，加入金霉素、四环素或氯霉素等抗生素或吐温60、吐温20或聚氧乙烯烷基醚等表面活性剂可抑制噬菌体的增殖或吸附；并在以后的发酵过程中应及时改用抗噬菌体生产菌株并轮换使用菌种。

（二）噬菌体的应用

1.用于细菌鉴定和分型

在生物学上，有些病原菌用其他方法很难鉴别。由于噬菌体的作用具有高度特异性，即一种噬菌体只能裂解和它相应的细菌，因此可用于细菌的鉴定。而且噬菌体的这种作用除具有种的特异性外，还具有型的特异性。一种噬菌体只能作用于该种细菌的某一型。于是可利用某一特定的噬菌体对细菌进行分型鉴定。

2.用于诊断和治疗疾病

噬菌体感染相应细菌后，在适宜培养条件下，迅速繁殖并产生大量子代噬菌体。利用这一特性可将已知噬菌体加入被检材料中共同培养，如果出现噬菌体效价增长，就证实材料中有相应的细菌存在。在疾病治疗中可以使用噬菌体来裂解细菌，特别是在治疗某些创伤感染时，由于多数细菌对多种抗生素都产生了耐药性，在药物治疗效果不佳的情况下，最有效的办法就是采用相应噬菌体来治疗。现利用葡萄球菌、链球菌，尤其是绿脓杆菌的噬菌体用于治疗已取得了良好的效果。

3.用作分子生物学研究的实验工具

噬菌体的基因数目少，噬菌体变异或遗传性缺陷株容易辨认、选择和进行遗传性分析，因此，可以通过物理或化学的方法诱变使其产生多种噬菌体的突变株，然后利用这些突变株进行基因重新组合试验，研究噬菌体基因的排列顺序和功能。

在基因工程研究方面，噬菌体可作为载体，例如，感染大肠杆菌（E. coli）的λ噬菌体，在其基因组中，约有一半是对自身生命活动十分必要的“必要基因”，另一半则是对其自身生命活动无重大影响的“非必要基因”，因此，可以被外源基因取代而建成良好的基因工程载体，将目的基因传递到另一细胞中，改变细胞的遗传特性。