恩施市传统发酵食品微生物多样性研究结果及讨论

1.基于DGGE技术的腊肠细菌多样性分析

本研究首先使用PCR-DGGE技术对腊肠样品中细菌的多样性进行了分析，其指纹图谱如图1-1所示。

图1-1　腊肠中细菌的DGGE图谱

注：编号1～7为优势条带编号，分别对应LC01～LC07。

由图1-1可知，条带6和条带7亮度远高于其他5个条带且在每个样品中均存在，这说明条带6和条带7所代表的细菌可能为腊肠样品中的优势菌属。值得一提的是，条带1～5亮度偏暗，且其仅在某几个腊肠样品中存在，这说明这些条带代表的菌属在腊肠中的含量偏低，且可能仅存在于部分样品中。由图1-1亦可知，LC1样品的条带数最多而LC5样品最少，这说明LC1样品的细菌多样性最高而LC5最低。各条带比对分析结果如表1-1所示。

表1-1　细菌DGGE条带测序结果

由表1-1可知，经比对发现腊肠样品中细菌由Anaerostipes hadrus（毛螺旋菌属）、Acinetobacter johnsonii（不动细菌属）、Vibrio litoralis（弧菌属）、Staphylococcus equorum（葡萄球菌属）、Brochothrix thermosphacta（环丝菌属）和未知分类地位的不可培养细菌构成，且Brochothrix（环丝菌属）为其优势细菌属。

2.基于Miseq高通量测序技术的腊肠细菌多样性评价

较之PCR-DGGE技术，以Miseq为代表的第二代高通量测序技术具有通量高的优点，且实现了菌群的相对定量分析，因而本研究进一步采用Miseq高通量测序技术对5个腊肠样品的细菌多样性进行了解析，同时对PCR-DGGE的结果进行了验证。通过Miseq高通量测序，本研究5个腊肠样品共产生193 486条高质量的16s rDNA序列，平均每个腊肠样品产生38 697条，切除引物和barcode后序列长度的分布情况如图1-2所示。

图1-2　序列长度分布图

由图1-2可知，193 486条高质量的16s rDNA序列中有175 308条集中在440～459 bp，占到序列总数的90.61%，18 069条集中在420～439bp，占到序列总数的9.34%。使用QIIME平台，对高质量序列进行生物信息学分析，共有193 356条序列通过Align（对齐），按照100%相似性进行UCLUST后共得到84 979条代表性序列，按照97%相似性进行UCLUST后共得到8 057个OTU且没有发现嵌合体。本研究进一步对OTU在5个样品中出现的频率和包含序列数进行了统计，结果如图1-3所示。

图1-3　OTU出现频率和包含序列数统计

由图1-3可知，在5个样品中出现1次、2次、3次和4次的OTU分别有6 742个、771个、289个和142个，分别占OTU总数的83.68%、9.57%、3.59%和1.76%，其包含的序列数分别为18 341条、11 093条、7 039条和19 140条，分别占所有质控后合格序列数的10.21%、5.76%、3.88%和10.13%。虽然核心OTU仅有113个，仅占OTU总数的1.40%，但其包含的序列数为137 743条，占所有质控后合格序列数的70.02%。由此可见，5个腊肠样品共有大量的细菌类群。(www.xing528.com)

使用RDP和Greengenes数据库比对后，所有序列鉴定到14个门、58个纲、90个目、110个科和261个属。各样品测序情况及各分类地位数量如表1-2所示。

表1-2　样品测序情况及各分类地位数量

注：超1指数和香农指数均在测序量为28 410条序列时计算所得。

由表1-2可知，LC1样品的超1指数和香农指数值均最大，而LC5样品的两个值均最小，这说明LC1样品的细菌多样性最高而LC5最低，与PCR-DGGE结果一致。本研究进一步在门水平上对腊肠样品中细菌多样性进行了解析，结果如图1-4所示。

图1-4　腊肠中优势细菌门相对含量的比较分析

由图1-4可知，腊肠样品中平均相对含量大于1.0%的细菌门分别为Firmicutes（硬壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Cyanobacteria（蓝细菌）、Bacteroidetes（拟杆菌门）和Actinobacteria（放线菌门），其平均相对含量分别为57.01%、30.43%、7.67%、2.63%和2.01%。此外，另有序列被鉴定为TM7、Acidobacteria（酸杆菌门）、Fusobacteria（梭杆菌门）、Deinococcus-Thermus（异常球菌-栖热菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Deferribacteres（脱铁杆菌门）、Spirochaetes（螺旋原虫）和Tenericutes（柔膜菌门），但其累计平均含量仅为0.13%。由此可见，腊肠样品中的细菌主要隶属于Firmicutes（硬壁菌门）和Proteobacteria（变形菌门），其比例占到细菌总数的87.44%。

经RDP和Greengenes数据库比对发现有13.72%的序列无法鉴定到属水平，相对含量大于1.0%的细菌属如图1-5所示。

图1-5　腊肠中优势细菌属相对含量的比较分析

由图1-5可知，腊肠样品中共有11个细菌属的平均相对含量大于1.0%，其中Brochothrix（环丝菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Lactobacillus（乳酸杆菌）和Leuconostoc（明串珠菌属）4个属隶属于Firmicutes（硬壁菌门），平均相对含量分别为38.34%、9.79%、2.80%和2.29%，Psychrobacter（嗜冷杆菌）、Photobacterium（发光杆菌）、Pseudomonas（绿脓杆菌）、Acinetobacter（不动细菌属）、Vibrio（弧菌）、Pantoea（泛菌属）和Klebsiella（克雷伯氏菌）7个属隶属于Proteobacteria（变形菌门），平均相对含量分别为7.55%、5.90%、4.82%、2.19%、1.69%、1.48%和1.33%。由此可见，腊肠样品中含量最多的细菌为Brochothrix（环丝菌属），这与DGGE结果一致。

本研究对142个相对含量大于1.0%的核心OTU进行了统计，其结果如图1-6所示。

图1-6　腊肠中优势核心OTU相对含量的比较分析

由图1-6可知，腊肠样品中OTU6108（隶属于Brochothrix）、OTU4346（隶属于Psychrobacter）、OTU4525（隶属于Staphylococcus）、OTU1679（隶属于Lactobacillus）、OTU1064（隶属于Vibrio）和OTU7759（隶属于Staphylococcus）的平均含量大于1.0%，其平均相对含量分别为36.19%、4.28%、3.35%、2.42%、1.50%、1.49%。由此可见，5个腊肠样品共有大量的细菌类群，6个核心OTU的含量就占到了序列总数的49.23%。