实验材料和方法详解

1.材料与试剂

酸豇豆采集自恩施土家族苗族自治州恩施市舞阳坝菜市场和土桥坝菜市场；MRS培养基：青岛海博生物技术有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl Trimethy Lammonium Bromide，CTAB）、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、甘油、过氧化氢、氯仿、饱和酚和异戊醇：国药集团化学试剂有限公司；10×PCR Buffer、rTaq酶和dNTP mix：北京全式金生物技术有限公司；正向引物27F（5’-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物1495R（5’-CTACGGCTACCTTG TTACGA-3’）：由武汉天一辉远有限公司合成；Axygen PCR清洁试剂盒，康宁生命科学吴江有限公司。

2.仪器与设备

DG250厌氧工作站：英国DWS公司；ECLIPSE Ci生物显微镜：日本Nikon公司；ND-2000C微量紫外分光光度计：美国Nano Drop公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；UVPCDS8000凝胶成像分析系统：美国ProteinSimple公司；vetiri梯度基因扩增仪：美国AB公司；5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；HWS24型恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；SA402B味觉分析系统：日本INSENT公司；PEN3型电子鼻：德国Airsense公司；BS224S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；PGJ-10-AS纯水仪：武汉品冠仪器设备有限公司。

3.方 法

（1）酸豇豆中潜在乳酸菌菌株的分离

采用倍比稀释的方法对酸豇豆样品中的菌群进行稀释，选取合适浓度的稀释液涂布于含有1.0%碳酸钙的MRS固体培养基中，在氮气、氢气和二氧化碳体积比为85∶10∶5的厌氧工作站中37 °C培养48 h。选取形态大小不同且有透明圈的单菌落进行分离并进行3代纯化，最终将过氧化氢酶实验为阴性且革兰氏染色为阳性的菌株定义为潜在乳酸菌菌株，并使用甘油保藏后置于－80 °C冰箱备用。

（2）酸豇豆中潜在乳酸菌菌株的鉴定

将潜在乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，37 °C培养24 h后3 000 r/min离心10 min收集菌体，使用CTAB法进行基因组DNA提取[14]，并以DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系：2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTP，正向和反向引物各0.5 μL，0.2 μL rTaq酶，1 μL DNA模板和18.3 μL无菌水[15]。PCR扩增条件为：95 °C 4 min；95 °C 45 s，55 °C 45 s，72 °C 90 s，循环30次；72 °C 10 min。PCR扩增结束后使用1.0%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物的扩增效果进行检测，上样量为2.5µL[16]。同时使用清洁试剂盒将扩增产物清洁后，进行克隆鉴定，并选取阳性克隆送往武汉天一辉远有限公司进行测序，反馈回的序列经拼接后在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对，依据序列同源性选取与相似度≥99%的模式菌株确定种属关系，并使用MEGA7.0软件进行系统发育树的构建。(www.xing528.com)

（3）L.plantarum纯种发酵酸豇豆的制作

将豇豆洗净沥干后切成长约5 cm的小段放入2L玻璃泡菜坛中，同时按照每250 g豇豆添加35.5 g食盐和600 mL纯净水的比例进行酸豇豆的制备。按照5×106/g豇豆的比例接入2）中鉴定出且活化了3代的L.plantarum菌悬液，搅拌均匀后泡菜坛口水封，置培养箱中30 °C发酵7 d。同时以未接入乳酸菌的酸豇豆作为对照组，且将其定义为自然发酵组。

（4）L.plantarum纯种发酵酸豇豆品质的评价

取（3）中发酵好的酸豇豆浆水3 000 r/min离心10 min取上清，使用SA402B电子舌参照王玉荣的方法进行酸、苦、涩、咸和鲜5个基本味及后味-A、后味-B和丰度3个回味指标相对强度的测定[17]，进而评价L.plantarum纯种发酵对酸豇豆滋味品质的影响。

亦取（3）中发酵好的酸豇豆浆水直接装入15 mL样品瓶中，55 °C水浴10 min后室温平衡20 min，参照杨成聪的方法使用PEN3电子鼻10组金属氧化物传感器对各敏感物质的响应值进行检测[18]，进而评价L.plantarum纯种发酵对酸豇豆风味品质的影响。

4.数据处理

采用箱形图对不同处理酸豇豆各滋味品质指标的差异性进行展示，采用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）对不同处理酸豇豆品质进行评价。使用Origin2017进行箱形图、PCA因子载荷图和因子得分图绘制，使用SAS9.0软件进行PCA。