快速检测蛋白质的方法优化

任务引入案例

原国家食品药品监督管理总局公布保健食品抽检名单发现10批次不合格产品

2014年，原国家食品药品监督管理总局组织开展了易非法添加的保健食品和蛋白粉类保健食品专项监督抽检工作，抽检产品类别涉及蛋白粉类以及声称减肥、通便、辅助降血糖、缓解体力疲劳、辅助降血压和增强免疫力（调节免疫）等功能保健食品。共抽检产品336批次，发现不合格产品10批次。

在不合格产品中，其中6批次产品蛋白质含量不符合国家标准规定，潮州市多合生物科技有限公司生产的多合牌蛋白质粉有1批次涉嫌假冒，蛋白质含量仅为7g/100g，远低于国家规定的≥50g/100g。

任务介绍

蛋白质（protein）是生物体细胞的重要组成成分，在细胞的结构和功能中起着重要的作用；蛋白质也是一类重要的产能营养素，并提供必需氨基酸；蛋白质亦是食品的主要成分，对食品的质构、风味和加工性状产生重大影响。

在化学组成上，蛋白质是一种复杂的大分子，相对分子质量在1万至几百万。根据元素分析，蛋白质由50%～55%碳、6%～7%氢、20%～23%氧、12%～19%氮和0.2%～3.0%硫等元素构成，有些蛋白质分子还含有铁、碘、磷或锌。大多数蛋白质含氮约16%，因该元素容易用凯氏定氮法进行测定，故蛋白质的含量可由氮的含量乘以6.25（100/16）计算出来。蛋白质在酸、碱或酶的作用下，完全水解的最终产物是侧链结构和性质各不相同的α-氨基酸，通常为22种基本氨基酸中的十几种。这些α-氨基酸以肽键（酰胺键）相连结形成几百个氨基酸残基的大分子化合物（蛋白质），类似结构的较小分子称为多肽（polypeptide）。虽然蛋白质的基本氨基酸种类有限，但由于氨基酸连结的顺序和比例不同，又可以形成不同的三维空间结构，从而形成性质不同和结构各异的成百上千种蛋白质。蛋白质的三维空间结构指蛋白质的一级、二级、三级和四级结构。

按照化学组成，蛋白质通常可以分为简单蛋白质和结合蛋白质。简单蛋白质是水解后只产生氨基酸的蛋白质；结合蛋白质是水解后不仅产生氨基酸，还产生其他有机或无机化合物（如碳水化合物、脂质、核酸、金属离子等）的蛋白质。结合蛋白质的非氨基酸部分称为辅基。具体分类如下：

1. 简单蛋白质（simple proteins）

（1）清蛋白（albumins）溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液，能被饱和硫酸铵所沉淀，加热可凝固。广泛存在于生物体内，如血清蛋白、乳清蛋白、蛋清蛋白等。

（2）球蛋白（globulins）不溶于水而溶于稀盐、稀酸和稀碱，为半饱和硫酸铵所沉淀。普遍存在于生物体内，如血清球蛋白、肌球蛋白和植物种子球蛋白等。

（3）谷蛋白（glutelins）不溶于水、乙醇及中性盐溶液，但易溶于稀酸或稀碱。如米谷蛋白和麦谷蛋白等。

（4）醇溶谷蛋白（prolamines）不溶于水及无水乙醇，但溶于70%～80%乙醇、稀酸和稀碱。分子中脯氨酸和酰胺较多，非极性侧链远较极性链多。这类蛋白质主要存在于谷物种子中，如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白等。

（5）组蛋白（histones）溶于水及稀酸，但为稀氨水所沉淀。分子中组氨酸、赖氨酸较多，分子呈碱性，如小牛胸腺组蛋白等。

（6）鱼精蛋白（protamines）溶于水及稀酸，不溶于氨水。分子中碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）特别多，因此呈碱性，如鲑精蛋白等。

（7）硬蛋白（seleroproteins）不溶于水、盐、稀酸或稀碱。这类蛋白质是动物体内作为结缔组织及保护功能的蛋白质，如角蛋白、胶原、网硬蛋白和弹性蛋白等。

2. 结合蛋白质（conjugated proteins）

（1）核蛋白（nucleoproteins）辅基是核酸，如脱氧核糖核蛋白、核糖体、烟草花叶病毒等。

（2）脂蛋白（lipoproteins）与脂质结合的蛋白质。脂质成分有磷脂、固醇和中性脂等，如血液中的β₁-脂蛋白、卵黄免疫球蛋白等。

（3）糖蛋白和黏蛋白（glycoproteins）辅基成分为半乳糖、甘露糖、己糖胺、己糖醛酸、唾液酸、硫酸或磷酸等中的一种或多种。糖蛋白可溶于碱性溶液中，如卵清蛋白、γ-球蛋白、血清类黏蛋白等。

（4）磷蛋白（phosphoproteins）磷酸基通过酯键与蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基侧链的羟基相连，如酪蛋白、胃蛋白酶等。

（5）血红素蛋白（hemoproteins）辅基为血红素。含铁的如血红蛋白、细胞色素c，含镁的有叶绿蛋白，含铜的有血蓝蛋白等。

（6）黄素蛋白（flavoproteins）辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸，如琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶等。

（7）金属蛋白（metalioprotein）与金属直接结合的蛋白质，如铁蛋白含铁、乙醇脱氢酶含锌、黄嘌呤氧化酶含钼和铁等。

蛋白质按其分子形状分为球状蛋白质和纤维状蛋白质两大类。球状蛋白质，分子对称性佳，外形接近球状或椭球状，溶解度较好，能结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质，对称性差，分子类似细棒或纤维，它又可分成可溶性纤维状蛋白质，如肌球蛋白、血纤维蛋白原等和不溶性纤维状蛋白质，包括胶原、弹性蛋白、角蛋白以及丝心蛋白等。

所有的由生物生产的蛋白质在理论上都可以作为食品蛋白质而加以利用，而实际上食品蛋白质是那些易于消化、无毒、富有营养、在食品中具有一定功能性质和来源丰富的蛋白质。乳、肉、水产品、蛋、谷物、豆类和油料种子是食品蛋白质的主要来源。为了满足人类对食品蛋白质日益增长的需要，不仅要寻找新的食品蛋白质资源和开发利用蛋白质的技术方法，而且还应提高对常规蛋白质的利用率和性能的改进。

食品中蛋白质含量的高低也是食品质量的重要指标，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。目前测定蛋白质方法的原理可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。食品中蛋白质检测的常规方法有：凯氏定氮法、燃烧定氮法、比色法（双缩脲法、Folin-酚法、BCA法、考马斯亮蓝法、茚三酮法）、近红外光谱法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法和胶束电动毛细管色谱法，此外还有极谱法、紫外吸收法、共振光散射光谱法、荧光法等其他方法。

目前国家标准对食品中蛋白质含量有严格的规定和要求，但在监督执法过程中，缺乏快速便捷的检测手段，因此急需研发能够快速检测食品中蛋白质的方法进行鉴伪及含量测定。

任务实操

实操一 Folin-酚快速检测法

1. 适用范围

适用于乳粉、牛乳、豆乳等乳制品中蛋白质含量的快速检测。

2. 检测原理

可溶性的蛋白质与Folin-酚试剂反应，Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物——蛋白质中含酚基的氨基酸还原为蓝色复合物，蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比。通过测定吸光值可以计算可溶性蛋白质的含量。

3. 检测步骤

（1）取乳粉2g（液体乳取4mL）放置于比色管或取样瓶中，加纯净水或蒸馏水至100mL，充分摇匀；然后从中取1mL 溶解乳液至另一比色管或取样瓶中，加纯净水或蒸馏水至40mL，充分混匀制备成样品待测液。

（2）取一支蛋白质检测管，加入0.5mL 样品待测液，盖上盖子摇匀，反应2min，观察颜色变化。

（3）每批检测必需按上述步骤做一个空白对照。

4. 结果判定

将样品的蛋白质检测管与标准比色卡进行比对，半定量判定样品中蛋白质的含量。方法检测下限为0.5g/100g。

5. 注意事项

（1）检测时各样品的提取时间、反应时间及操作方法应尽可能保持平行一致。检测时若产生沉淀，提示蛋白质含量可能较高，应稀释后再测定。

（2）若样品有结块或难以溶解的现象，需对样品液加热或直接以热水稀释样品，以使样品充分溶解。

（3）检测试剂具有腐蚀性，使用时需小心操作以防止检测液渗漏；若万一不小心沾到检测液，可用清水冲洗干净；用过的检测管应妥善处理，不可乱丢或让儿童接触到。

实操二 考马斯亮蓝速测管法

1. 适用范围

本方法适用于乳粉、牛乳、豆乳等乳制品中蛋白质含量的快速检测。

2. 检测原理

考马斯亮蓝试剂在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。检测范围：液体样品为0.5～20g/100g，固体样品为1～40g/100g。

3. 检测步骤

取乳粉2g（液体乳取4mL）于容器中，加纯净水或蒸馏水至100mL，充分摇匀；从中取1mL至另一容器中，加纯净水或蒸馏水至40mL，充分混匀成样品待测液。(www.xing528.com)

4. 结果判定

取一支蛋白质检测管，加入0.5mL 样品待测液，盖上盖子摇匀，反应2min，观察颜色变化，根据标准比色卡进行半定量判定；每批检测需做一个纯净水或蒸馏水的空白对照。

5. 注意事项

（1）检测时各样品的提取时间、反应时间及操作方法应尽可能保持平行一致。检测时若产生沉淀，提示蛋白质含量可能较高，应稀释后再测定。

（2）若样品有结块或难以溶解的现象，需对样品液加热或直接以热水稀释样品，以使样品充分溶解。

（3）当样品中蛋白质含量低于产品包装标示含量或国家标准规定含量时，应送有资质的检测机构进一步确认。

6. 试剂质量控制

定期与国标法检测进行比对，所得结果差异应在±20%以内。

实操三 双缩脲比色法快速测定蛋白质含量

1. 适用范围

适用于牛乳（不包括酸乳和乳饮料）、乳粉中蛋白质含量的快速检测。不适用于酸牛乳和乳饮料中蛋白质的测定。

2. 检测原理

蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与二价铜离子作用生成蓝紫色化合物。化合物颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质相对分子质量及氨基酸成分无关，通过与标准比色可测定蛋白质含量。

3. 检测步骤

（1）样品前处理

①牛乳样品：无需处理，直接取少量乳样于离心管中，待检测。

②乳粉样品：称取1g乳粉于离心管中，用蒸馏水溶解并定容至10mL，待检测。

（2）样品检测 将试纸条上的试纸部分浸入样品中约1～2s，沿着离心管边缘取出试纸（以便除去多余的样品溶液），计时5min，计时结束立即与标准比色板进行比较判断。

4. 结果判定

（1）标准比色板判断：若试纸颜色与标准比色板色块颜色一致，相同色块代表的含量即为标准色卡读数；若试纸颜色在两个色阶之间，其标准比色卡上读数取二者的中间值。

（2）牛乳样品直接从标准比色卡上读数；乳粉样品标准比色卡上的读数乘以10。

（3）与国家限量标准进行比较（见表3-1），判断出被测样品中蛋白质含量是否达标。

表3-1 乳及乳制品中蛋白质含量指标

*非脂乳固体（%）=100%-脂肪（%）-水分（%）-蔗糖（%）。

5. 注意事项

（1）本方法为半定量法，测定结果不能作为最终判据；若需准确定量，需送权威机构检测。

（2）试纸取出后，应立即盖好瓶盖，并且尽快使用试纸条。

实操四 食品中蛋白质含量快速检测

1. 适用范围

适用于食品中蛋白质的快速检测。

2. 检测仪器

CEM Sprint真蛋白质分析仪。

3. 仪器工作原理

使用蛋白质融合标签（iTAG）技术，此标签只能结合蛋白质链上的氨基，不能结合非蛋白质（三聚氰胺）链上的氨基结构。检测时，将已知含量的带标签的检测溶液与样品进行混合，标签与蛋白质结合，过量的标签可以通过内置的色度计测定含量，经过仪器计算显示样品中蛋白质含量。

4. 检测步骤

（1）打开仪器，选择相应的检测方法。

（2）称量样品。

（3）将样品放置于蛋白仪样品检测区。

（4）启动样品检测按钮，2～3min后机器将显示样品蛋白质含量。

5. 仪器特点

（1）直接测量“真蛋白质”，而非总氮含量。

（2）直接测量真蛋白质，排除非蛋白氮的干扰。

（3）可用于多种类型样品检测（液体、固体、粉末状、奶油、肉类、坚果类、谷物、种子等）。

（4）操作简单，无需有经验的化学家。

（5）无需危险的化学试剂。

（6）无需校准和维护，样品无需前处理。

（7）检测方法满足美国分析化学家协会（AOAC），美国谷物化学师协会（AACC）的要求。

任务拓展

GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》修订介绍。

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