使用θ（h）方法优化水解大豆蛋白的功能性质

蛋白质水解工艺过程的设计需要解决的重要技术问题包括：水解反应过程本身的控制、过程物料的平衡、关键影响因素的鉴别以及合适工艺设备的选择。在工业化规模的蛋白质水解中，关于水解参数可能遇到以下两方面问题。首先，它们无法像在实验室里那样得到精确的控制；其次，为了获得最佳工艺条件，必须对水解参数作相当大的改动。θ（h）方法则是专门用于评估水解参数是否为最佳工艺条件的一种统计方法，其可靠性已经被大量实验数据所证实。

以水解反应的终止为例，由于大规模酶反应罐的体积可达到10m³，如若采用原地升温法以钝化酶，则罐中物料不可能很快升温。比较实际的解决方法是让物料通过热交换器来加热。然而，如果交换器不具有巨大的换热面积，那么后通过换热器的物料将比先通过换热器物料的反应时间长得多。对此则可借助于θ（h）方法，消除上述反应时间不均的问题，从而设计出比较合理的工艺。

1.蛋白质酶水解工艺中的重要变量

如前所述，蛋白质酶水解反应体系的参数包括底物浓度[S]、酶—底物比E/S、pH、温度T以及时间t。然而，基于以下两方面的理由，我们必须鉴别出其中哪些参数是对水解反应的结果是重要的。首先，有限的试验不能对系统中所有变量进行优化。通过找出重要变量，例如用DH，而不是时间作为结束水解的标准，将可以减少变量数，有助于试验数据的系统研究。其次，在工业化酶水解工艺中，不同批次的产品质量能否再现将与重要变量密切相关。另外，若把蛋白水解工艺从实验室放大，常常需要满足特殊的要求，例如降低物料粘度，以保证反映在限定时间内完毕，以上几个方面都意味着要对重要水解变量作调整。

从酶反应动力学可知，在水解反应DH恒定的情况下，若改变[S]、E/S、和T（不包括pH），通常使反应速率v相对于原标准速率w产生变化。由此推论，只要DH保持不变，则水解参数的变化将对产物的性质没有影响。因此，原先给出的五个水解参数中，其中四个（[S]、E/S、T和t）可以被一个重要变量DH所代替，而余下的pH是另一个重要变量。

上述观点已经在大豆蛋白-Alcalase体系中得到证实。试验证明，只要DH不变，[S]、E/S、T的变化对水解大豆蛋白的pH7溶解指数、pH4.7溶解指数、TCA溶解度、以及乳化能力和起泡能力没有影响。由此可作一般性推论如下：给出两组水解参数，其中一组为标准状态，反应速率曲线为w（h），改变标准状态的某一水解参数，得到另一组水解参数，其反应速率曲线为v（h）。如果对所有的h，v（h）与w（h）之比为一常数，则两组水解蛋白的性质相同。这也就是说这一水解参数不是重要变量。因此，通过v（h）与w（h）的比值，我们可以鉴别哪一个水解参数是重要变量。θ（h）方法正是应用于这一目的的统计学方法，见图9-13。

2.θ（h）方法的原理

当[S]、E/S、T的变化一定时，从理论上探讨其对v（h）的影响是容易的，但实践起来却不那么简单。因为从水解曲线上通过微分求速率会产生很大的误差。θ（h）方法则是比较反应速率的积分曲线，从而可以减少误差。

任何水解曲线：h=F（t）或t=G（h）

标准水解曲线：η=Φ（t）或τ=Γ（h）

θ（h）=G（h）/Γ（h）=t/τ

图9-13 水解速率与水解当量的关系曲线

可以证明，如果θ（h）=常数，则v（h）/w（h）=v（0）/w（0）=常数

以下是应用θ（h）方法将用于考察水解参数变化的影响，基本的计算步骤为：(www.xing528.com)

（1）用相应的标准水解曲线计算θ（h）值

（2）选定h_min和h_max

（3）作回归分析，得到回归系数b、总方差SSD、SSD（h）、以及θ（0），注意实验次数n及SSD（h）取决于h区间的大小

（4）计算SSD：

（5）SSD对SSD₀作F检验

如果F值显著，则该水解曲线的零假设：θ（h）=常数，被拒绝，用星号（*）标注显著性水平。

（6）对于零假设未被拒绝的m个水解曲线，可共同作χ²检验

（7）如果χ²检验被接受，则可以根据m个θ（0）值可计算参数函数，

由此得出结论，通过利用θ（h）方法可以来控制水解大豆蛋白的功能性质。具体描述如下：

（1）在一定范围内，[S]、E/S、T不是重要参数，只要DH一定，改变上述参数，水解蛋白的性能不变，[S]、E/S、T可以用DH代替。

（2）若θ（h）=常数，则达到一定DH的时间与E/S成反比，因此，对于一个给定的水解产物，可以方便地改变E/S，以便在合适的时间内完成水解，同时水解产物性能不变。

（3）pH是除DH之外的另一个重要水解参数，改变pH不仅使水解速度改变，而且形成性能不同的水解产物。