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PCR扩增技术在刑事侦查中的应用

时间:2023-07-26 理论教育 版权反馈
【摘要】:1985年,Kary Mullis等发明了PCR技术,实现了DNA在体外的复制扩增。STR基因座的DNA多态性可用PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色法检测,通过待测样品扩增产物与等位基因标记物比较,可准确地判断扩增产物片段的大小。表5-3常规PCR扩增成分变性:加热使反应体系的温度达到95℃,模板DNA打开形成单链;Tm值,即熔链温度,为95℃。PCR扩增PCR反应总体积为25μL,内含DNA模板0.5~1.0 ng和2×PCR反应混合物12.5μL、10×Primer混合物2.5μL。

PCR扩增技术在刑事侦查中的应用

聚合酶链式反应(PCR),是在DNA聚合酶的催化作用下,在体外复制特异性的DNA片段的技术,扩增过程类似于DNA在细胞内的半保留复制。

1985年,Kary Mullis等发明了PCR技术,实现了DNA在体外的复制扩增。1990年,Mullis和Saiki等发明并改进的PCR技术被用于DNA分析,从而建立了以PCR为基础的DNA分型技术,核心是应用PCR技术扩增人类基因组DNA中高度多态性位点,扩增产物经过片段长度多态性分析或序列多态性分析,研究不同个体间DNA分子水平上的差异及其遗传规律。

STR等位基因片段小,核心序列长度为2~6 bp,可用于测定陈旧检材中已经降解了的DNA。STR基因座的DNA多态性可用PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及硝酸银染色法检测,通过待测样品扩增产物与等位基因标记物比较,可准确地判断扩增产物片段的大小。现在通行的是荧光标记毛细管电泳自动化检测分型技术。

PCR反应体系如下:

(1)模板DNA:采用Chelex100处理后,取1μL加入反应体系,其他方式提取的加1 ng。模板提供的是整套的基因组DNA,要检测的Y-DNA只是其中的一小片段,即靶DNA。靶DNA的位置和大小可通过引物来选择。

(2)引物:人工设计合成的与靶DNA片段两端侧翼序列互补的小段DNA。其作用是寻找要扩增的靶DNA片段,特异性结合到靶DNA的侧翼,在其基础上延长DNA链,形成与靶DNA互补的片段,实现对靶DNA的半保留复制。引物以一定浓度加入反应体系中。

(3)三磷酸脱氧核苷酸(dNTP):是合成DNA的基础材料,以一定的浓度加入反应体系之中。

(4)反应缓冲液:含有电解质,具有一定的pH值,提供DNA可复制的环境

(5)DNA聚合酶(Taq酶):具有良好的耐热性,能够在体外催化核苷酸的聚合反应,是实现DNA体外复制扩增的关键试剂

将上述材料加入试管中,放入扩增仪进行DNA扩增(见表5-3)。随着扩增仪模块的温度变化,DNA经过“变性”“退火”“延伸”三个步骤的往复循环,靶DNA被复制。(www.xing528.com)

表5-3 常规PCR扩增成分

变性:加热使反应体系的温度达到95℃,模板DNA打开形成单链;Tm值,即熔链温度,为95℃。

退火:反应体系温度降至56℃,引物与靶DNA侧翼序列互补结合。

延伸:反应体系温度上升至72℃,在Taq酶的作用下引物延伸,合成一条与靶DNA序列互补的新DNA链。

每经过一次扩增循环,靶DNA片段就被复制一次,前一循环合成的DNA链在后一循环就成为模板,如此循环下去。理论上,一个DNA片段被复制为2n个,常规试验中,循环次数一般为25~36次(见图5-2)。

PCR扩增PCR反应总体积为25μL,内含DNA模板0.5~1.0 ng和2×PCR反应混合物(含有MgCl2、dNTPs、HS-Taq等)12.5μL、10×Primer混合物(含有荧光标记和未标记的引物等)2.5μL。在9700型热循环仪上进行复合扩增,热循环条件为:95℃10 min,94℃10 s,61℃1 min,70℃30 s,26~30个循环,60℃15 min。4℃保温。

图5-2 PCR的基本原理

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