实用传染病疫苗研究现状，重要进展

1.丙型肝炎疫苗

几乎所有的HCV患者在急性感染早期都会产生HCV抗原特异性抗体。大多数慢性HCV患者外周血单核细胞对HCV结构蛋白和非结构蛋白的刺激都有增生反应。从HCV慢性患者的肝样本或其外周血中都检测到了广谱的HCV特异性细胞毒淋巴细胞（CTL）。这些细胞所产生的促炎症细胞因子在HCV引起的肝损伤和病理进程中起重要作用。显然，慢性HCV感染的原因与抗体、细胞免疫和CTL缺乏无关。上述结果对HCV疫苗的开发提出了严峻挑战。

研究表明，患者和黑猩猩体内早期诱发的多特异性CD4+T和CD8+T细胞反应可以有效清除病毒。这两种类型T细胞都可以分泌IFN-γ，这种细胞因子在体外培养的细胞中对HCV复制子具有直接的抗病毒作用，在急性感染期则可以大量减少病毒滴度。此外，利用表面携带HCV包膜蛋白的慢性病毒HCV假型颗粒（HCVPP）进行检测患者体内的抗体，发现其不只与一种基因型的颗粒反应，而且可以与多种基因型的HCV颗粒反应，说明患者体内存在应用范围较广的交叉中和性抗体。

科学家们为了研制有效的HCV疫苗，进行了各种尝试，采用了各种策略，例如，重组病毒疫苗、DNA疫苗、融合蛋白疫苗、口服疫苗等。研究的热点包括包膜蛋白E1/E2、核心蛋白C到非结构蛋白NS3以及NS5。目前正在研制的HCV疫苗主要有两大类：重组蛋白疫苗和核酸疫苗。另外，还有一些新型的HCV疫苗如病毒样颗粒疫苗、细胞表位疫苗等。但是，还没有一种成功的HCV疫苗问世。

（1）重组蛋白疫苗：研究者最先选择的抗原是HCV编码的糖蛋白。动物细胞表达的两种膜蛋白E1和E2形成了无二硫键连接的糖蛋白gPEl-gPE2异二聚体。与水/油构成的佐剂混匀后，免疫黑猩猩，可以诱导抗包膜蛋白抗体反应和Th细胞反应。早期的实验表明，如果用与El、E2同源的病毒攻击，抗体滴度最高的黑猩猩可以得到完全的保护反应。这种保护反应与高滴度的E2抗体直接相关，该抗体能够阻止E2与CD81的结合。而且，尽管抗体水平较低的黑猩猩感染了HCV，但大多数阻断了急性感染，只有少数发展为慢性感染。利用HCV-H株攻击9只黑猩猩，尽管没有一只黑猩猩免于急性感染，但是除了一只以外，其他所有黑猩猩都清除了急性感染并且没有进入慢性感染。说明疫苗可以明显减少慢性的持续感染，表明gPEl-gPE2异二聚体疫苗是有效的，提示HCVE1、E2包膜蛋白可能是HCV疫苗的必需的成分。

核心蛋白抗原也是HCV疫苗的候选靶目标之一，即便HCV患者体内存在很强的CTL反应的条件下，HCV核心蛋白基因中也没有检测到突变。而且研究表明，该蛋白可以诱发理想的体液免疫及细胞免疫应答。目前，利用ISCOMATKIX作为佐剂的核心蛋白已经进入Ⅰ期临床试验，在猴和健康人体内能诱导针对核心蛋白内保守表位的CD4+和CD8+反应，因此可以作为理想的靶位点。

（2）核酸疫苗：用编码HCV膜蛋白E2的质粒免疫大猩猩后，尽管大猩猩对同质单克隆HCV病毒株的攻击没有保护作用，但可以促进大猩猩从病毒感染中康复，而未经免疫的对照动物则发展为慢性丙肝感染者。表达HCV核心蛋白的质粒在BALB/C小鼠中可以产生很强的CTL反应，抗E1、E2抗体，抗H：1抗体滴度最高可达1∶320，抗E2抗体滴度最高可达1∶1280，IFN-7分泌也显著高于对照组。

抗HCV非结构蛋白：S3、NS4和NS5的DNA疫苗能在BALB/c小鼠中诱发CD8+CTL反应。不同形式的HCVNS3 DNA疫苗在HLA-A2.1转基因小鼠模型体内诱导免疫反应。表达NS3与溶酶体相关膜蛋白组成的融合蛋白的质粒能够诱导产生很强的CTL效应，并且持续很长时间。该模型也可用来检测HCVNS3转化的减毒鼠伤寒沙门菌的口服疫苗。这种方法可以诱导产生强的细胞毒和分泌IFN-γ的CD8+T细胞。

（3）病毒样颗粒疫苗：Baumert等用纯化的HCV-LPlb作为包被抗原，发现HCV-LP能和不同基因型（1-6型）HCV感染的慢性丙型肝炎患者血清反应，滴度高达16 000～64 000。Xiang等研究显示，HCV-LP能与19%抗体检测阴性但RNA阳性的丙型肝炎患者血清反应。

用HCV-LP免疫BALB/c小鼠后发现：①能诱导很强的体液免疫应答，产生的抗C和E2蛋白抗体能与不同基因型HCV的对应蛋白反应。②抗体的产生存在明显的抗原剂量依赖性。③HCV-LP通过MHCI类途径，诱导产生了抗HCV的细胞免疫应答，包括特异性CTL应答和Th应答。HCV-LP免疫小鼠的脾细胞经C蛋白刺激能引起强烈的淋巴细胞增生反应，而E1和E2蛋白对淋巴细胞增殖作用较弱。分别用稳定表达HCVC蛋白或E1或E2蛋白的P815细胞作为靶细胞测定HCV-LP免疫鼠中的特异性CTL杀伤活性，证实E2蛋白诱导CTL活性能力最强。④加热变性的HCV-LP诱导的体液和细胞免疫应答很弱，表明其免疫原性依赖于颗粒构象。⑤含和不含P7蛋白的HCV-LP诱导的体液免疫应答基本相同，但诱导细胞免疫应答能力后者较前者强。初步表明P7蛋白有调节Thl和Th2型应答的功能。⑥佐剂1 668 Pt（含CPG基序的寡核苷酸）和DC2 Chol（阳离子脂类-胆固醇复合物）单独或者联合使用均不能显著加强HCV-LP的免疫原性。但Qiao等的研究则显示，使用佐剂10 105（含CPG基序的寡核苷酸）或AS01 B（单磷酰脂类A与QS21的复合物）均能增强HCV-LP的免疫原性，如果两者联合使用还可发挥协同作用，使HCV-LP的免疫效果更好。

（4）CTL表位疫苗：HCV急性感染后，机体针对病毒产生了由中和抗体、CD4+Th细胞和CD8+CTL介导的适应性免疫反应，但是仍然缺乏有效的保护性免疫，因而使多数患者转成慢性感染。由于HCV包膜蛋白的高度变异，使产生的中和抗体难以有效地阻止和清除病毒感染，从而使得细胞免疫的作用尤为突出。人体感染HCV后，大多数人的细胞免疫应答很弱，因此，较易发展为慢性肝炎，但是也有少数人的细胞免疫应答较强，可以清除病毒，完全康复。越来越多的研究表明，特异性的CTL反应在清除HCV和阻止病毒传播中起到最关键的作用。因此，HCV的CTL免疫表位研究和利用将对预防和治疗性HCV疫苗的研制起到关键作用。

在HCV基因组中，C区基因最为保守，抗原表位较为集中，刺激产生的应答最强，是HCV疫苗的必需组分。核心区存在多个不同HLA（人类白细胞抗原）限制性CTL表位，主要集中在氨基端。报道最多的是A2限制性35～34 aa、90～98 aa、132～140 aa。HCV的E区存在中和抗原表位，是产生体液免疫的关键区域，但HCVE2区存在高变区。因此，在研制针对E区产生中和抗体为主的预防性疫苗的研究一直进展缓慢。HCV非结构区存在多个优势CTL表位，尤其是HLA-A2限制性的CTL表位，经多种方法（四聚物染色分析、ELISPOT以及HCV患者的PB-MC与合成肽的细胞毒分析实验等）证实，在诱导特异性的细胞免疫应答方面起重要作用。

2.肠道病毒71型（EV71）疫苗

肠道病毒71型是手足口病（HFMD）的主要病原体，感染引起的严重伤害和死亡病例已经成为政府和社会高度关注的公共卫生问题。研究显示，HFMD重症病例中81.59%、死亡病例中96.43%是由EV71引起的。HFMD多发于儿童，疫苗是控制该疾病流行和暴发的唯一有效手段。

自我国台湾地区1998年HFMD大流行后，该地区以及新加坡等国家或地区先后开始进行相关疫苗的研究。疫苗种类主要集中在灭活疫苗、重组疫苗、多肽疫苗和减毒活疫苗等几个方面，但大多仍处于临床前研究阶段。

我国科技部于2008年5月立项，将HFMD的疫苗和诊断试剂研发分别列入科技支撑项目予以重点支持。目前，国内已有多家企业采取不同来源的毒株以及不同工艺来进行EV71疫苗的研发。在疫苗毒株的筛选和确定、细胞基质的选择、灭活工艺的优化和验证、质量控制、疫苗免疫原性动物模型评价等方面均取得了较大的进展。疫苗生产采用的毒株主要为国内流行的C4型毒株；应用的细胞基质主要为Vero细胞和二倍体细胞；灭活疫苗由于细胞基质、生产工艺和质量控制等方面均较为成熟，因此，国内研发单位多选择灭活疫苗进行研发，并取得了初步进展，已有厂家产品完成了Ⅰ、Ⅱ期临床试验，初步结果良好。

目前尚未阐明EV71毒力的位点，因此出于安全性考虑，减毒活疫苗的研发受到限制，而基因工程疫苗由于需表达免疫原性高的VLP颗粒以及吸收率、纯度等工艺要求，目前尚无大的突破。

3.艾滋病疫苗(https://www.xing528.com)

自从1981年报道第一例艾滋病患者以来，全球已有6300万人感染人类免疫缺陷病毒（HIV）。目前全球每天新增约14 000名HIV感染者，但至今仍无可以治愈的药物。在回顾全球艾滋病防治头十年历史中，得出的一个教训是过去在强调宣传教育、行为干预作为预防艾滋病流行的主要措施的同时，忽视了作为生物医学干预重要手段的HIV疫苗的研究。因此，国际社会做出了在进一步加大以宣教为主的行为干预的同时，大力加强HIV疫苗研究的重大策略调整。20世纪90年代初，我国政府开始立项进行艾滋病疫苗的研究。

根据疫苗的用途，在研的艾滋病疫苗分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗使用对象是未感染艾滋病病毒者，其目标是：①预防艾滋病病毒感染；②若感染艾滋病病毒，可以减缓或预防疾病；③若感染艾滋病病毒后比较不易传染给他人。最好的疫苗就是保护机体免受病毒的侵袭。治疗性疫苗是为已感染艾滋病病毒的人研制的，帮助他们的免疫系统控制体内的艾滋病病毒。治疗性疫苗的目的是阻止艾滋感染者恶化发病。当与药物同时应用时，可在艾滋病治疗药物杀死大量病毒后，用疫苗清除感染者细胞内残存的病毒，如能奏效，将可能使已感染艾滋病病毒者不需终身服药，起到单纯药物治疗不能达到的作用。

传统的HIV疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗。由于其安全性不能保证，已被排除在候选疫苗之外。近年来，随着分子生物学及基因工程技术的发展，新型的HIV疫苗以其较好的安全性和可操作性，成为HIV疫苗研发的主流。其中主要包括亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒、活载体疫苗等基因工程疫苗和合成多肽疫苗等。

对艾滋病病毒来说，免疫功能中的体液性免疫成分──抗体、补体和急性反应蛋白等可以附着在艾滋病病毒上，阻止病毒不感染细胞；此外，抗体也可以活化免疫功能的其他成分，发挥拮抗病毒的作用。免疫功能中的细胞性免疫成分──细胞毒性T淋巴细胞，可以对抗艾滋病病毒，它们识别体内已感染病毒的细胞，并且在它们复制前把它们杀死。有效的疫苗是诱导机体产生中和抗体和细胞毒性T细胞，拮抗HIV的感染和阻断其传播。因此，艾滋病疫苗的研究专注于免疫功能的两个方面：体液免疫和细胞免疫。

（1）以刺激机体产生细胞免疫反应为主的疫苗：2007年9月，默克公司的HIV疫苗临床Ⅱb期试验宣布停止。疫苗利用rAD5分别表达病毒的gag、pol和nef编码区，旨在刺激机体产生HIV特异性的T细胞免疫反应，从而保护机体免受病毒感染或降低体内的病毒载量。评估试验从澳大利亚及南美、北美的一些国家选取了1500名HIV阴性志愿者接种疫苗，参加这项“分步”临床实验。首次公布的结果表明，表达HIV gag、pol或nef编码区的重组疫苗均不能保护接种者免受艾滋病病毒的感染。更令人吃惊的是，接种疫苗的人群中比接种对照试剂组出现了更多的新的HIV感染。似乎接种疫苗者更容易被HIV所感染；并且体内rAD5的抗体水平越高，机体就越容易被HIV感染。迫于这个结果，默克公司停止了对志愿者的临床试验。

2008年8月，在印度进行的一项使用腺相关病毒作为载体、针对印度主要流行的HIV-1的C亚型的HIV疫苗临床试验被停止。原因是该疫苗虽然符合安全准则，但在多数志愿者体内不能诱导产生特异性免疫反应。

疫苗试验比较满意的结果应该是可以诱导大量膜蛋白抗体的产生或很强的T细胞介导的免疫应答。如果要使产生的抗体对全身或黏膜感染具有良好的保护作用，抗体的特异性及中和抗体的浓度需要特别考虑，而如何设计出能针对少数几个可变区域产生抗体且又有特异性的抗原是问题的关键。对高度变异的病原体，其疫苗开发一般都集中在细胞介导的免疫应答方面，在慢性HIV感染过程中，细胞介导的免疫应答控制和清除着大量的病毒。但是对HIV感染细胞的T细胞杀伤活性尚缺乏功能性的评估，可能会限制对接下来的疫苗免疫原性研究的预测。同时，现在仍然没有找到一个理想的、可信赖的动物模型，这也成为制约HIV疫苗研究的另一个瓶颈。

（2）以刺激机体产生特异性抗体为主的疫苗：经典的成功疫苗都是以诱导机体产生足够强的体液免疫为主。部分研究者认为，最有效的HIV疫苗应该产生强有力的具抗病毒作用的中和抗体。有研究证明，被动转运中和抗体可以诱发猴子体内的系统免疫和黏膜免疫，对病毒的攻击起到有效的保护作用。与其他的急性致病病原体不同，HIV的基因组通过整合可以长期潜伏在宿主细胞内，而且基因变异率高可逃避机体的免疫监视功能，逃避抗体反应。这些给疫苗的开发带来了许多困难。目前正在临床受试的HIV疫苗都不能诱导机体产生针对全球范围病毒分离株的有效的广谱中和抗体，因此，如何诱导机体产生具保护性作用的抗体就成了此类疫苗开发所要解决的主要问题。此外，HIV独特的蛋白质外壳（包膜）包被了HIV表面可以与抗体结合的位点，使得体液免疫的抗体不容易识别并攻击HIV。这也是以刺激机体产生抗体为主的HIV疫苗研究的难点问题。

（3）以刺激机体产生黏膜免疫为主的疫苗：黏膜是HIV主要感染途径之一，胃肠道和阴道黏膜是HIV进入机体和初始感染的主要组织部位，所以，黏膜免疫在预防HIV感染中有不可忽视的作用。已有研究表明，高滴度的IgG单克隆抗体的被动转移能保护猴子抵抗黏膜感染。针对HIV的有效疫苗可以通过黏膜表面使用以产生细胞免疫应答和分泌型IgA。有报道证明，用颗粒性SIVP27蛋白经直肠加口服或阴道加口服途径接种恒河猴可以在其直肠和阴道黏膜产生SIV特异性CD8+CTL反应。这种黏膜免疫在今后的HIV疫苗研制中应该得到应有的重视。

4.通用流感疫苗

目前广泛使用的流感疫苗基本上是由对人类危害较大的两种甲型流感病毒（H1N1和H3 N2）和一种乙型流感病毒组成的三价疫苗，主要包括全病毒灭活流感疫苗、裂解灭活流感疫苗、冷适应减毒活疫苗和流感亚单位型疫苗。亚单位疫苗主要是针对流感病毒表面糖蛋白分子HA和NA设计的，通过诱导产生中和性抗体从而起到保护机体免受病毒感染的作用。流感病毒变异的速度远远快于其他大多数病毒，尤其是HA和NA的变异相当频繁，接种者即使对一种流感具有免疫力，仍可能对另一种流感病毒的侵袭没有抵抗力，因此，疫苗的生产要随着流感病毒流行毒株的变异而及时更新。流行病毒疫苗株的选育费时费力，生产周期长、成本高，且难以适应防控流感大流行的需要。为了解决这些问题，科学家们和疫苗生产商一直在努力研究一种能够预防所有流感病毒毒株，并可诱导持久保护性免疫的疫苗，即所谓的通用流感疫苗。

（1）基于m2蛋白的通用流感疫苗：甲型流感病毒的m2蛋白是由病毒基因组第7节段编码的，具高度保守性。自1933年从雪貂中分离出流感病毒以来，经历几次大流行和无数次的小流行，m2蛋白的核苷酸序列基本上没有发生大的变异。m2蛋白以同源四聚体的形式存在于内脂膜上，具有质子泵作用，通过控制质子通道活性可调节病毒内的pH值，从而影响流感病毒的复制。虽然m2蛋白在甲型流感病毒包膜上仅呈现低密度的表达，但在感染细胞的胞膜上却分布广泛。

Treanor等用m2的单克隆抗体14 C2被动免疫小鼠，可明显降低致病性流感病毒攻击时小鼠鼻部和肺部的病毒滴度。Jegerlehner等用m2 e-HBc免疫小鼠，发现诱导的抗m2 e抗体具有保护作用，但抗体不能直接有效地与病毒结合并中和病毒，而是通过抗体依赖细胞介导的细胞杀伤发挥作用。有研究者将表达m2胞外域m2 e蛋白的基因插入强黏膜免疫佐剂CTA1-DD中，在大肠杆菌中成功表达了CTA1-m2 e-DD融合蛋白，鼻腔免疫小鼠后能够产生强烈的体液免疫应答，同时发现含有3个m2 e的CTAl-3 m2 e-DD的融合蛋白更能够保护小鼠抵御同型和异型流感病毒（H3 N2、H1N1）的攻击。Lalor等以甲型流感病毒的m2蛋白及NP或HA全基因为目的基因构建了真核表达质粒，并以Vaxfectin为佐剂分别免疫BALB/c小鼠和雪貂，用致死量的A/Viemam/1 203/04（H5N1）流感病毒攻击小鼠和雪貂，发现经过重组的真核表达质粒有较好的保护作用。

（2）基于NP的流感通用疫苗：流感病毒核蛋白由流感病毒的第5节RNA编码，是构成流感病毒核糖核蛋白（RNP）的主要成分aNP与病毒基因组RNA及病毒聚合酶形成RNP复合体，参与流感病毒基因组的复制和转录。NP也是CTL反应的主要靶抗原，能够诱导机体的细胞免疫，产生亚型间的交叉免疫保护。应用全长NP或从中获取高度保守区段作为候选的通用免疫原是可能的。Altstein等发现将表达流感病毒NP的重组痘苗病毒疫苗免疫小鼠，不仅能够抵御流感病毒H3 N2的攻击，同时还能够抵御禽流感病毒H5 N2的攻击。

也有些研究运用流感病毒Ml、NS1蛋白，这是流感病毒编码的另两种较为保守的病毒蛋白，联合m2蛋白或NP制备流感疫苗，能够产生不同亚型的交叉性保护。这种基于多种病毒蛋白质、高度保守的、能覆盖各类HLA类型的多表位复合免疫原，可能是今后流感病毒通用疫苗的一个重要的研究方向。

控制传染性疾病最主要的手段是预防，而接种疫苗是最行之有效的措施。威胁人类几百年的天花病毒在牛痘疫苗出现后被彻底消灭，乙肝、脊髓灰质炎、麻疹等疫苗的成功应用，都确立了疫苗在控制和消灭传染性疾病中的作用和地位。目前在研究的传染病相关疫苗还有EBV、HPV、HEV、腺病毒、轮状病毒、登革病毒、汉坦病毒，以及针对疟疾等的多种疫苗，相信在今后的传染病防治事业中，疫苗将会发挥更大的、决定性的作用。