突发呼吸道传染病PCR检验样本的采集、运送、保存及核酸提取

在突发呼吸道传染病PCR检验中，临床标本的采集、运送和保存对检验结果会产生决定性的影响。因此，为保证得到高质量和准确的检验结果，必须有一个规范的临床标本采集、运送和保存的程序。常用的呼吸道传染病标本通常有鼻、咽拭子、痰、组织、尿液、脑脊液及其他体液等，这些标本中常含有脂类、蛋白质和核酸酶等干扰核酸扩增的物质，所以核酸提取是进行核酸扩增前必需的一个步骤。

核酸分离纯化技术起源于20世纪50年代，在20世纪70年代和80年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广，但由于传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤，不但烦琐，而且增加了环境因素对标本及标本间相互污染的机会。不但在使用极为敏感的聚合酶链反应（PCR）检测时，易得到假阳性结果，而且当检测RNA时，也极易出现假阴性。同时，由于这些方法要用到一些挥发性的有机溶剂，对实验操作人员的身体健康造成一定的影响。因此，简单而又高效且无须使用酚和氯仿的核酸提取方法对敏感的PCR技术的广泛应用有重要意义。此外，标本的处理及保存对DNA和RNA（尤其RNA）的影响较大，在核酸测定时，标本的处理及适当保存，对保证测定的准确有效尤为重要。在呼吸道传染病PCR检验中，常涉及的标本如鼻、咽拭子、痰、分泌物、体液等，这些临床样本的处理和保存方法各不相同。

（一）突发呼吸道传染病样本采集

临床PCR实验室对各种临床标本的收集应按检测要求建立标准操作程序（SOP），并对临床标本采集人员进行培训。标本采集要注意的重点是，一定要在合适的时间正确采集样本，并注意使用正确的标本容器，采集的方法程序对有些临床标本非常重要，如用于新冠病毒核酸检测的鼻、咽拭子标本等。为落实联防联控机制《关于做好新冠肺炎疫情常态化防控工作的指导意见》要求，国家卫健委于2020年12月28日制定《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）》。该手册（试行）进一步规范新冠病毒核酸检测的技术人员、标本采集与管理、实验室管理、核酸检测结果反馈等工作，保证检测质量，提高检测效率，满足新冠病毒核酸检测的需求。

（二）标本采集的时间对扩增检测结果的影响

在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。当病原体感染机体后，在特定的临床标本中，病原体含量能达到PCR检出水平的点，并不能覆盖整个感染过程，可能只是在感染或疾病发生发展过程中的某一个时间段。如严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）感染，其在感染发病后3～4d，即可以较高浓度出现于下或上呼吸道标本中，在第10～13d，在尿液和粪便中出现的浓度最高，而在血液中，则不但存在时间短，而且浓度低。(https://www.xing528.com)

（三）标本采集部位的准备

在采集标本之前，通常需对标本采集部位进行清洁消毒，以去掉污染的微生物或其他杂物，但应适度，因此，标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。如采集不当，对结果可能就影响很大。

（四）标本的类型和采集量

在病原体的检测中，培养始终是“金标准”。这也决定了我们应该选择什么样的标本用于特定病原体的PCR检测。如痰液用于肺结核的结核分枝杆菌的检测，鼻、咽拭子用于新冠病毒核酸检测等。对于PCR扩增检测来说，在一个扩增反应管内只要有一分子病原体核酸，在理想反应条件下就可以检测出来。但为尽可能检出存在的病原体，就要尽大量采集可能含病原体的标本。但PCR总反应体积是限定的，通常为50uL，其中经核酸提取后标本的加入量，通常小于10uL。此外，由于不同PCR实验室所用的试剂盒在核酸提取、上样量和扩增条件上均可能不同，测定下限也有差异，因此，使用不同试剂盒进行定性测定有可能结果不一样。对于定量测定来说，对标本的收集和运输要求就更为精确。