在果蝇体内探究基因功能时,往往需要在时间和空间上,特异地控制目的基因的表达。而二元表达系统作为一种灵活多变的遗传学工具,可以通过遗传学操作,实现时空特异的基因表达调控。常见的二元表达系统主要有Gal4/UAS系统、LexA/LexAop系统、tTA/TRE系统和Q系统。虽然这些系统都可以实现目的基因的表达调控,但是综合这些系统在果蝇中的表达效率、方便程度、应用状况来看,Gal4/UAS系统是最受欢迎的二元表达系统。
Gal4/UAS系统是在酵母中被发现、可以调节半乳糖代谢的表达体系,其中Gal4蛋白可以结合上游激活序列(upstream activation sequence,UAS),然后激活半乳糖利用基因的转录,以调节半乳糖代谢。
Gal4蛋白的N端可以形成二聚体,并结合UAS序列;C端可以通过结合SAGA复合物,并招募中介体(mediator)复合物以及其他转录激活机器,起始转录活动的发生。
在研发Gal4/UAS系统之前,基因的过表达通常是将目的基因的CDS克隆到热激(heat shock)启动子之后,或者连接到组织特异性的启动子后。前者虽然能够诱导目的基因的过表达,但是没有组织器官特异性,在全身均有过表达而经常导致果蝇死亡,无法研究目的基因发育后期的功能;而后者克隆步骤繁琐,并且只能有限地增加目的基因的表达量。所以,这两种方式并不能有效地实现基因的过表达调控。
依靠着布兰德(A.Brand)的酵母遗传学和分子生物学背景以及佩里蒙(N.Perrimon)的果蝇遗传学知识,果蝇中的Gal4/UAS系统由他们两位在哈佛医学院共同研发。
布兰德当时正在进行Gal4的相关研究,并且发现酵母中的Gal4通过结合UAS序列激活转录的功能,在人类、斑马鱼、果蝇等物种中仍然保守。随后,布兰德在一次学术交流过程中受到了格林(W.Gehring)的启发,格林介绍了他们在果蝇中通过增强子捕获(enhancer trapping)方法确定了一系列组织细胞特异的DNA调控序列。布兰德马上意识到,如果将Gal4放入这些序列的位置,那么就可能在特定的组织和细胞中,实现UAS下游基因的特异性表达。(www.xing528.com)
二元表达系统Gal4/UAS利用组织细胞特异性表达Gal4的不同转基因果蝇,以及携带UAS目的基因的转基因果蝇,只需要两者简单地杂交,就可以实现特定时间与空间上的基因过表达。自从这项技术被研发以来,不同的Gal4转基因果蝇品系数量不断增加。现在世界上存在数千个Gal4转基因果蝇品系,它们可以与任意的UAS转基因果蝇杂交,实现特定基因在特定时间、特定组织细胞中的过表达。同一基因的UAS转基因果蝇,也可与不同的Gal4转基因果蝇杂交,用于探究同一基因在不同发育阶段、不同组织细胞中的功能。
为了在更加精确的时间窗上调控目的基因表达,人们构建了Gal80—G203R单个氨基酸点突变形式的温度敏感型的Gal80ts。在18℃时,Gal80ts可以结合Gal4蛋白的C端,并抑制其转录激活的功能。而在29℃时,Gal80ts不再能结合Gal4,并释放Gal4转录激活的功能。这样就可以通过简单改变果蝇培养的温度,来精确控制基因表达的时间,真正准确地实现目的基因在特定时间、特定位置上的表达调控。
Gal/UAS工作模式图
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