生命科学基础研究入门：RT-PCR技术及其应用

逆转录PCR（RT-PCR）是逆转录与PCR的联合，即先以RNA为模板，用逆转录酶催化合成其cDNA，再以cDNA为模板，用Taq酶通过PCR扩增其特异序列。逆转录PCR常用于基因表达分析、cDNA克隆、cDNA探针制备、转录体系制备、遗传病诊断、RNA病毒检测。

逆转录PCR能否成功，逆转录引物很关键。根据所掌握目的RNA的信息，可以选用：①oligo（dT）引物（12～18nt），针对mRNA的poly（A）尾。②随机引物（6nt），不需要mRNA序列信息。随机引物和oligo（dT）引物统称普通引物（general primer）。③特异性引物（20～30nt），针对mRNA的特异序列。对于特异性引物，如果根据不同外显子的编码序列设计引物，可以鉴别cDNA和基因组DNA扩增产物。

如果同时设计内参照，则用逆转录PCR可以对mRNA进行定性和半定量分析，可检测低丰度mRNA（不到10个拷贝）。

逆转录PCR可以采用一步法：逆转录和PCR在一个反应体系中进行。也可以采用两步法：逆转录和PCR在两个反应体系中分开进行。

【实验原理】

RT-PCR（逆转录—聚合酶链反应）是对某一特定的RNA分子进行扩增。RT-PCR分成两个步骤：首先，以目的基因mRNA为模板，利用逆转录酶的活性，合成相对应的cDNA；然后以cDNA为模板，加入目的基因特异引物和四种脱氧核糖核苷酸，利用Taq DNA聚合酶的活性，扩增出大量特异的目的DNA分子。本实验利用小麦β-管蛋白的特异引物扩增β-管蛋白的全长编码基因。

仪器、材料与试剂基本与PCR相同，除此之外还需要：

（1）特异引物

（2）RNase抑制剂

（3）RT-PCR试剂盒

【实验步骤】

（1）总RNA的提取

（2）cDNA第一链的合成（RT）

2×Bca 1st buffer　　　　　　　　　　　　5μL

硫酸镁（MgSO4 25mmol/L）　2μL

dNTP 混合物（10mmol/L each）　0.5μL

oligo dT引物　0.2μL

特异下游引物　0.5μL

RNA酶即制剂（RNase Inhibitor 40U/μL）　0.3μL

BcaBEST polymerase（22U/μL）　0.5μL(www.xing528.com)

模板（总 RNA）　0.5μg（xμL）

用无RNA酶的蒸馏水补足10μL体系，进行如下循环：

65℃，1 min；30℃，5min；65℃，30min；沸水，5min；5℃，5min。

（3）PCR 扩增

在0.5mL小指管中，加入下列试剂混匀即为溶液I：

5XBca 2nd buffer　16μL

硫酸镁（MgSO425mmol/L）　6μL

正向引物（10pmol/μL）　1μL

反向引物（10pmol/μL）　1μL

Bca一 Optimized Taq酶　0.5μL

双蒸水　55.5μL

（4）在0.2mLPCR管中，按下表配制PCR反应液

（5）轻轻混匀，进行如下循环

94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃复性1min，72℃延伸2min，循环30次，最后72℃继续延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR结果。

配制1%琼脂糖凝胶30mL（1XTAE），加1.5ul ColdViewTW。

1.5ul PCR扩增产物+6ul10×loading-buffer混匀，全都上样电泳，恒压80V。

阳性对照目的是检测RT-PCR反应体系，阴性对照为检测提取的RNA中是否有DNA污染，若有污染则阴性对照会出现条带。