蛋白质定量检测方法及注意事项

（一）紫外分光光度法

（1）原理

蛋白质分子中常含有带共轭双键的酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等结构，因而蛋白质在紫外光波段有吸收，其最大波长在280nm处。在此波长范围内，其吸收值与蛋白质浓度成正比，可做定量测定。

（2）实验器材及试剂

①实验器材：紫外分光光度计、吸管、试管及试管架。

②标准蛋白溶液：任选一种标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白、胰蛋白酶、肠毒素、核糖核酸酶等），准确称量，用适当的溶液（水、缓冲液或0.9%NaCl溶液）溶解并配制成1mg/mL的溶液。

（3）实验操作步骤

①标准曲线的绘制：按表6-1加入不同的溶液。

表6-1　紫外可见分光光度法测定蛋白质含量的标准曲线绘制表

各管混匀后，在280nm处，以 “0”管调零，测量其光密度值，以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

②样本的测定：取待测溶液1mL，加入蒸馏水3mL，按标准管的测量方法测定其在280nm处的光密度值，并从标准曲线上查出待测样本中蛋白质的浓度。若样品液超出了标准曲线范围，可对样品液进行稀释后再测定，最后乘以稀释倍数即可。

（4）核酸干扰的校正

①原理：在蛋白质制备过程中常常会混杂有核酸物质，核酸在280nm处也有吸收，会影响蛋白质的测定。但是核酸在260nm处的紫外吸收比其在280nm处更强，而蛋白质则相反，在280nm处的紫外吸收大于260nm处，利用此性质，通过适当的计算可校正核酸对蛋白质紫外分光光度法测定的干扰。

②方法：分别测定样品液在280nm和260nm处的光密度值（OD），计算出OD280nm/OD260nm的比值，查出校正因子P值，同时可查出样液中混杂的核酸含量。

将F值代入下列经验公式可计算出样液中蛋白质的浓度：

蛋白质浓度（mg/mL）=DO280nm×D（D—样品液的稀释倍数）

或用下列经验公式求得：

蛋白质浓度（mg/mL）=1.55×OD280nm-0.76×OD260nm。

纯的蛋白质OD280nm/OD260nm约为1.80，纯的核酸比值约为0.50。

（5）实验注意事项

①该方法不受低浓度盐的干扰，测定后样品液可回收利用，因此，在蛋白质柱层析分离中，该方法常被应用来检查蛋白质的洗脱。但该法特异性较差，对于那些与标准蛋白质的氨基酸组成差异较大的蛋白质的测量有一定的误差。核酸的存在即使进行了上述的校正，因为不同的蛋白质和核酸的吸收是不同的，因而仍存在一定的误差。

②蛋白质紫外吸收会随着pH的改变而改变，因而测定过程中要保持样品管和标准管的pH尽量一致。

③测量时一定注意使用石英比色杯，因为玻璃可吸收紫外波长的光。

④不同的标准蛋白质在1mg/mL时有不同的吸收值，不要错误地认为1cm比色杯中测量的吸收值为1.0时，蛋白质浓度大约为1mg/mL。

（二）双缩脲法测定蛋白质浓度

（1）原理

蛋白质因含有两个以上的肽键而具有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质和Cu2+反应可形成紫红色的络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用于蛋白质定量检测。

（2）实验器材与试剂

①实验器材：可见分光光度计、吸管、试管与试管架。

②蛋白标准溶液：准确称取标准蛋白物质（牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白等），用0.05mol/L氢氧化钠溶液稀释至10mg/mL。

③双缩脲试剂：溶解1.5g硫酸铜（Cu2SO4·5H2O）和6.0g酒石酸钾钠。（NaKC4H4 O6·4H2O）于500mL水中，在搅拌下加入300mL 10%氢氧化钠溶液，用水稀释至1L，储存在内壁涂以石蜡的瓶中，可长期保存。(www.xing528.com)

（3）实验步骤

①标准曲线的绘制：按表6-2加入不同的溶液。

表6-2　双缩脲法测定蛋白质浓度标准曲线绘制表

各管在室温下放置30min，于540nm波长下，以 “0”管调零，测定其光密度值。以蛋白质含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

②样本的测定：用0.05mol/L氢氧化钠配制成适当的浓度，使测定值在标准曲线范围内，取待测溶液1mL，用水补足2mL，按标准管的测量方法测定其在540nm处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的含量。按稀释倍数求出样品中蛋白质的浓度。

（4）实验注意事项：

①注意分光光度计使用注意事项。

②标准管和样品管应同时操作并使各管显色的时间尽可能保持一致。若室温过低，可统一采用25℃温浴进行显色。

③该法适用于0.5～10mg/mL的蛋白质溶液的测定。

④巯基乙醇及具有肽性的缓冲液（如Tris缓冲液）会干扰测定，可用等体积10%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白质，弃去上清液，再用已知体积的0.05～0.10mol/L氢氧化钠溶解蛋白质。硫酸铵不影响测定，因而用硫酸铵分级沉淀初步提纯的蛋白质含量可用此法进行测定。

（三）Lowry法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质浓度

（1）原理

该法实际上是双缩脲法的进一步发展。试剂A相当于双缩脲试剂，蛋白质在碱性蛋白质在碱性条件下与其中的Ca2+形成络合物。由于蛋白质含带有酚基的酪氨酸，生成的络合物可还原试剂B中的磷钼酸和磷钨酸而产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用于定量分析。

（2）实验器材与试剂

①实验器材：分光光度计、吸管、试管和试管架。

②Folin酚试剂A：称取0.5g Cu2SO4·5H2O溶于100mL 1%的酒石酸钾钠溶液中，配成A1溶液；称取20g碳酸钠溶于1000mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液中，配成A2溶液；按A1∶A2=1∶50体积比混合，即可得到Folin-酚试剂A。

③Folin酚试剂B：称取100g钨酸钠和25g钼酸钠，加入700mL水和85%的磷酸溶液50mL及浓盐酸100mL，充分混匀后小火回流10小时，加入硫酸锂150g，50mL水和数滴溴水，开口沸腾15分钟去除过量的溴，冷却后稀释到100mL，过滤，滤液呈黄绿色，装于棕色瓶中，暗处储存，此液也可购买，使用时将自制或购买的试剂B，以酚酞为指示剂，标准氢氧化钠溶液滴定，然后用水稀释至酸浓度为1mol/L，此即Folin-酚试剂B。

④标准蛋白质溶液：准确称取标准蛋白物质（牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白等），用0.05mol/L氢氧化钠溶液稀释至0.5mg/mL。

（3）实验步骤

①标准曲线的绘制：按表6-3加入不同溶液。

表6-3　Lowry法测定蛋白质浓度的标准曲线绘制表

混匀，室温放置30分钟，以 “0”管调零，60m波长处测量光密度值，以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。

②样本测定：取待测溶液0.5mL，按标准管的测量方法测定其在660nm处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质含量。按稀释倍数求出样品中蛋白质的浓度。

（4）实验注意事项

①注意分光光度计使用注意事项。

②此法较双缩脲法灵敏100倍，可用于0.05～0.5mg/mL蛋白质浓度测定。

③对酪氨酸和色氨酸含量与标准蛋白质差异较大的样品会产生一定的测量误差。

④Folin-酚试剂只在酸性溶液中稳定，但本实验在pH10条件下反应，因而加入Folin-酚试剂后立即混匀，使Folin-酚试剂在被破坏之前就和溶液发生反应。

⑤枸橼酸、琥珀酸等缓冲液，EDTA等螯合剂，葡萄糖、蔗糖等糖类，酚、巯基乙醇等还原剂，Triton等去垢剂，高浓度的尿素、硫酸铵、三氯乙酸等均会干扰测定，因而本法适用于较纯的蛋白样品测定。去垢剂糖类和EDTA的干扰可通过在Folin-酚试剂中加入SDS消除。其他干扰可通过对照实验消除。