仪器分析中的荧光分析法应用

在药物分析中，能采用荧光分析法的物质也能采用紫外-可见分光光度法测定，应根据对分析的要求来选择分析方法。荧光分析法比紫外-可见分光光度法灵敏度高，但精密度稍逊色些，且易受系统误差的影响。所以，紫外-可见分光光度法广泛应用于药物和制剂的分析，而荧光分析法一般用于需要高灵敏度和允许较大变异性的生物样品的药物分析，特别适用于药物在体内降解、代谢和排泄速率方面的研究。荧光分析法还可考虑用于微量物质的分析，某些甾体激素类、生物碱类和其它剂量很小的单剂量药物分析等。

药物的荧光分析法分为直接荧光测定法和间接荧光测定法两类。间接荧光测定法，一种情况是因为被测物质不产生荧光或产生的荧光太弱，无法直接测定，通过一定的化学或生物反应，从而生成能产生良好荧光的新化合物，通过测定新化合物而推算被测物质含量的方法；另一种情况是被测物能使某种标准荧光物质荧光定量降低或熄灭，从而测定熄灭剂含量的方法。以下介绍这些类型方法的基本原理和应用。

1.直接荧光测定法

当被测药物分子在特定波长激发光的照射下就能产生足够良好的荧光，可以采用直接测定法。因荧光物质的性质易受pH影响，故荧光测定时需控制在pH适宜的介质中进行。对于成分复杂的生化检测品，应进行适当的生化纯化（如溶剂萃取、沉淀过滤、色谱分离）以除去杂质的干扰，降低荧光本底、提高检测灵敏度。纯化方法取决于生化分子的结构和性质。

2.间接荧光测定法

（1）化学引导荧光测定法

利用化学反应方法可使一些自身不产生荧光的化合物转变为荧光化合物。这可能是由于化学反应产物增加了π电子共轭系统的长度或增加分子结构的刚性平面性所致。常见的化学反应方法如下。

氧化还原反应　例如，血浆中苯妥英的测定。先经二氯乙烷萃取，再转提入NaOH溶液后，用KMnO4氧化二苯酮。后者经正己烷萃取，浓H2SO4回提，在H2SO4介质条件下产生强烈荧光，其λex为360nm，λem为490nm。

水解反应　氨苄青霉素在pH2酸性缓冲溶液中，以甲醛为催化剂，90℃加入2h，水解生成具有强烈黄色荧光的化合物。经溶液萃取后，于2mol/L NaOH溶液中测定F值，其λex为346nm，λem为422nm。用于血清样品的测定，水解生成的荧光产物为哌嗪二酮衍生物。

缩合反应　色胺和5-羟基胺与甲醛或苯甲醛缩合，生成tetrahydronorharman，经氧化后生成一个发强荧光的norharman，其λex为365nm，λem为440nm。

血清中异味烟肼的测定，可利用其在醋酸性质溶液中与水杨醛缩合成腙，经巯基乙醇还原后有强烈的荧光，其λex为392nm，λem为478nm。检出限为0.01μg/mL血清。

配合反应　四环素类药物与Ca2+及巴比妥盐形成具有荧光的配合物，经萃取进入有机相后，用荧光法测定，可用于各种液体样品的分析。Day认为四环素与Ca2+络合的基团是4-位即12α-位，巴比妥参与配合物的组成，使配合物的溶脂性增加，易被有机溶剂萃取。氨基酸可与吡哆醛缩合后与Zn2+络合再进行荧光测定。

光化学反应　氯氮平在pH4.8的甘氨酸-盐酸缓冲溶液中经沸水浴加热，水解成内酰胺衍生物，再用乙醚萃取，以0.1mol/L NaOH回提，在碱性溶液中用日光照射，由光催化重排成具有荧光的4,5-环氧化物异构体，血浆样品调节pH7.5，以乙醚萃取、蒸干，取残渣按上述方法分析，检测限为0.25μg/mL。

硫酸引导荧光　甾体化合物在浓H2SO4作用下可因质子化而产生荧光。17α-烷基-17β-羟基-4,6-二烯-3-酮用硫酸处理，可转变为高荧光的17β-甲基-17α-烷基-4,6,8（14）-三烯-3-酮，反应式如下：

吗啡、可待因和狄奥尼在浓H2SO4中加热，溶液呈碱性后，反应产物呈荧光。

（2）制备荧光衍生物测定法

①生成荧光衍生物

将待测物与荧光试剂反应，生成荧光衍生物，然后测定。常用荧光试剂有胺荧、邻苯二甲醛及丹酰氯等。

胺类　用于含伯胺、仲胺或潜在胺基的药物测定，生成有强烈荧光的吡咯啉酮。(www.xing528.com)

例如测定尿中氯氮䓬，可利用其水解产物三甲胺与胺荧的反应，在样品尿液中加入pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和NaCl固体，以异戊醇-乙烷（1.5︰98.5）萃取，萃取液经0.45mol/L NaOH洗涤，再以1.5mol/L HCl回提，然后水浴加热水解，再用NaOH中和，加入pH9.5的硼酸盐缓冲溶液及胺荧试液，反应完成后测F值，其λex为390nm,λem为486nm。

又如组织中的氯霉素测定，可先经Zn和HCl还原，使硝基转变为芳香胺基，再于pH=4.3~5.0溶液中与胺荧反应。

丹酰氯　常用于含氨基药物的测定，还可用于含酚羟基药物（如雌激素）的测定。

邻苯二甲醛　常用于伯胺类及α-氨基酸类化合物的荧光分析。例如用于磺胺类药物的含量测定。

②生成荧光离子对

有机碱药物与水溶性酸性荧光染料络合形成中性离子对，可用于有机溶剂提取后测定其荧光强度。Glako等研究了各种酸性染料用于测定有机碱药物的测定条件。例如氯丙嗪与四溴荧光素形成离子对，用于测定氯丙嗪含量。张立明等报道9,10-二甲基蒽-2-磺酸钠（MAS）在pH2～4的溶液中可与叔胺类药物生成离子对，以1,2-二氯乙烷萃取，测定了6种叔胺类药物的含量。

（3）猝灭荧光测定法

本法基于药物与荧光试剂反应，生成的产物能猝灭荧光试剂的荧光，与试剂空白比较降低了荧光强度，是测定样品液荧光强度减弱的定量方法。例如，芳伯胺类药物经重氮化后，与Bratton-Marshall试剂[N-（1-萘基）-乙二胺]偶合，偶合产物可猝灭该试剂的荧光，与试剂空白对照，测得反应液荧光强度的降低程度（减失量）与药物含量成正比。

（4）化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析（CIA），用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术，是最新发展起来的一项免疫测定技术。

在化学发光免疫分析方法中，可在抗原或抗体上标记活性物质（酶或荧光化合物），通过测定荧光来确定标记抗原-抗体结合率而进行的药物定量分析。这种方法兼具荧光分析的灵敏度和免疫分析的专一性，是一种超微量的分析方法，能分析10-12～10-15mol/L的生物样品。与放射免疫分析（RIA）相比，无使用放射性同位素所带来的安全性问题。下面介绍两种常见的化学发光免疫分析法。

①荧光免疫分析（FIA）

用荧光化合物标记在抗原或抗体上，常用的荧光标记化合物有鲁米诺（luminol）及其衍生物、焦棓酚（pyrogallol，焦性没食子酸、1,2,3-苯三酚）等。将其用适当的化学方法结合至抗原或抗体上，形成标记共轭物，经抗原-抗体反应后，分离抗原-抗体的结合型（B）和游离型（F），用H2O2-K3Fe(CN)6（催化剂）系统或H2O2-微晶过氧化酶系统使荧光标记化合物氧化发光，通过测定标记抗原-抗体结合物的发光率（与结合率有关）来测定待测物（通常作为抗原）的含量。鲁米诺的化学发光机制如下：

②酶免疫分析（EIA）

将酶标记在被测药物有特异性的抗体上，经抗原-抗体反应后，分离标记抗原-抗体的结合型（B）和其游离型（F），用荧光法测定酶活性，确定标记抗原-抗体结合率。可由标准曲线法测定抗原（药物）的含量。

常用的酶有过氧化酶（POD）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。用过氧化酶酶标的EIA中，经标记抗原-抗体结合型和游离型分离（B/F分离）后，用鲁米诺-H2O2或焦棓酚-H2O2作底物，与标记的过氧化酶的催化作用，使鲁米诺（或焦棓酚）和H2O2间产生氧化还原反应，同时发光。测定发光强度即可测得相应的酶活性。用葡萄糖氧化酶酶标的EIA中，B/F分离后，先进入葡萄糖作底物，生成H2O2，氧化由鲁米诺[Fe(CN)6]3--或双-（2,4,6-三氯苯）草酸盐（TCPO）-荧光色素组成的检测系统，测定发光量。以TCPO-荧光色素的检测系统为例：

上述方法需要经过B/F分离操作。近年来免疫分析的发展趋向是不经B/F分离，直接测定标记抗原-抗体的结合体，被分析化学家们称赞的有能量转移方法、固相荧光免疫分析和荧光偏振免疫分析。