仪器分析：化学键合相探究

采用化学反应的方式将固定液的官能团键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相，简称键合相。键合相一般采用全多孔或薄壳型微粒硅胶作为基体，这种硅胶的机械强度好、表面硅醇基反应活性高、表面积和孔结构易于控制。键合相具有化学性质稳定，热稳定性好，载样量大，适于作梯度洗脱，使用过程不流失等优点。

为增加硅胶表面参与键合反应的硅醇基数量，通常将硅胶用2mol/L盐酸浸泡过夜，使其表面充分活化并除去金属杂质。据计算，经活化处理的硅胶含硅醇基约有8μmol/m2，但由于位阻效应，实际上硅胶表面含硅醇基最多只有一半参与跟其它官能团的键合反应，剩余的硅醇基被已键合上的官能团所屏蔽，形成“刷子”的结构（如下左所示）或“尖桩篱笆”结构（如下右所示），分析物与键合相的相互作用仅发生在键合烷基的顶部，下面的游离硅醇基已被屏蔽，与分析物无相互作用。硅胶表面积越大，其键合量也越大。

键合相的“刷子”结构

1—键合相碳链；2—键合相官能团

键合相的“尖桩篱笆”结构

1—键合相碳链；2—键合相官能团；3—组分分子

1.键合固定相的制备和分类

用于制备键合固定相的化学反应可分为三种类型。

（1）形成键

使硅胶表面的硅醇基与正辛醇、聚乙二醇400等醇类进行酯化反应而制成。

这是最先用来制备键合相的化学反应，在硅胶表面形成大分子层的硅酸酯。此类固定相有良好的传质特性和高柱效，但其易水解、醇解、热稳定性差，当用水或醇作流动相时，键合的Si―O―C键易断裂，一般只能使用极性弱的有机溶剂作流动相，用于分离极性化合物，致使其应用范围受到限制。它在pH=2～8范围内保持热稳定性和化学稳定性。

（2）形成键

使硅胶表面的硅醇基先与黄酰氯反应，生成氯化硅胶（1），再与格氏试剂或烷基锂反应，生成具有碳硅键的苯基或烷基键合固定相（2）。氯化硅胶也可与伯胺（乙二胺）反应，生成具有硅氮键的胺基键合固定相（3）。

上述两类键合相中，硅碳键和硅氮键要比Si―O―C键稳定，其耐热、抗水解能力优于硅酸酯类固定相，适于在pH=4～8的介质中使用。

（3）形成键

当硅胶表面的硅醇基与氯代硅烷或烷氧基硅烷进行硅烷化反应时，就生成此类键合固定相。这也是制备化学键合固定相的最主要方法。硅烷化试剂含有1～3个官能团，可进行如下基本反应：

式中，X代表等官能团；R、R′和R′既可以是互不相同的基团，也可以是全相同的基团，这些基团有等。

硅胶表面参与反应的硅醇基与硅烷化试剂分子的摩尔比为1∶1～2︰1。显然，硅烷化试剂的反应按X3SiR、X2SiRR′、XSiRR′R′的顺序降低，但三个X基团都与硅醇基反应的可能性很小。为获得单分子层的键合相，使用的硅胶、硅烷化试剂和溶剂必须严格脱水，并在较高温度下进行键合反应。由于空间位阻效应的存在，分子体积较大的硅烷化试剂，不可能与硅胶表面的硅醇基全部发生反应，残余的硅醇基会对键合相的分离性能产生一定的影响，特别是在非极性键合相的情况下，硅醇基的存在会降低表面的疏水性，而对极性化合物或溶剂产生吸附，使键合相的分离性能改变。为防止上述现象的发生，通常在键合反应后，再用小分子硅烷化试剂（如三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺）进行封尾处理，以消除残余的硅醇基，并提高化学键合相的稳定性和色谱分离性能的重复性。

非极性键合相是目前最广泛应用的柱填料，尤其是十八烷基硅烷键合相（Octadecylsily，ODS）在反相液相色谱中发挥着重要作用，它可完成HPLC分析任务的70%～80%。反相液相色谱系统操作简单、稳定性与重复性好，它的分离对象几乎涉及所有类型的有机化合物：极性、非极性；水溶性、脂溶性；离子型、非离子型；小分子、大分子；具有官能团差别或分子量差别的同系物，均可采用反相液相色谱技术实现分离。

2.键合固定相的性质

（1）表征键合相的参数

表征键合相的参数有表面键合官能团浓度、表面碳覆盖率、有机官能团的表面覆盖率等。其中，表面键合官能团的浓度，表达式为

式中，B表示载体上键合的有机官能团；m为B的质量，μg；M为B的摩尔质量，g/mol；S为载体的比表面积，m2/g。文献报道，一般α=2～4μmol/m2。

因篇幅所限，表面碳覆盖率ω(C)/%和有机官能团的表面覆盖率SC(B)/%本书不予介绍。

（2）影响溶质保留行为的因素

烷基键合相的碳链越长，其保留值也越大，保留因子k(C18)>k(C8)。(www.xing528.com)

对ODS固定相，其烷基覆盖量以硅胶表面含碳的质量分数表示，可达ω(C)/%=5%～40%，覆盖量越大，对溶质的保留值也越大。苯基和酚基键合相常用于反相色谱。

硅胶表面残留硅醇基会影响溶质的保留机理，对碱性化合物产生吸附效应，引起色谱峰的拖尾或不对称，影响色谱柱的稳定性和保留行为的重复性。

氨基、氰基、芳硝基、二醇基、醚基键合相皆可用作正相色谱，它们主要以氢键力与溶质相互作用，其氢键力依下列顺序逐渐减弱：胺基>氰基>芳硝基>二醇基>醚基。

胺基键合相兼有质子接受体和给予体的双重性能，具有碱性和形成氢键的能力，用于分离酚、羧酸、核苷酸。胺基用作反相固定相可与糖羟基作用，用于单糖、双糖及多糖的分离。

氰基键合相为质子接受体，具有中等极性，对酸性、碱性样品可获得对称的色谱峰；对含双键的异构体或双键环状化合物具有良好的分离能力。

芳硝基键合相具有电荷转移功能，呈弱极性，对芳香族化合物良好的分离选择性。

二醇基键合相呈弱极性，可用于分离有机酸、低聚物、蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相。

醚基键合相也呈弱极性，可分离能形成氢键的化合物，如酚类和硝基化合物。

3.键合固定相的使用注意事项

（1）稳定性

反相烷基键合相的稳定性与使用的流动相pH值相关，通常水溶液的pH值应保持在2～8，pH>8.5会引起基体硅胶的溶解，pH<1.0，键合的硅烷会被水解而从柱中洗脱下来。

为了减小硅胶键合相中残留硅醇基对色谱分离的不良影响，可采用以下措施：利用具有低pH值的流动相抑制硅醇基的解离；借助增加（或减小）流动相的pH值来抑制碱性（或酸性）组分的解离；在流动相中加入一种竞争试剂，可借助封闭硅醇基来进一步降低峰形拖尾，如三甲基胺、烷基胺化合物等。

（2）重现性

使用键合相时，经常会遇到同一种类型键合相，因厂商不同而表现出不同的分离特性，所以应尽量使用同一厂商的色谱柱，以保证分析结果有良好的重现性。

（3）选择性

在反相色谱分析中，使用同一种ODS固定相，并用两种组成不同，但极性参数P′值相近的溶剂作流动相时，会获得不同的分析结果，这是由于溶剂诱导选择性的变化所致。例如，采用μ-Bondapak ODS固定相上，分离山梨酸和苯甲酸，使用40%甲醇-水溶液（P′=8.160）流动相则不能分离，而使用32.5%四氢呋喃-水溶液（P′=8.185）却能完全分离。

（4）再生

使用键合相色谱柱时，由于大量使用极性或非极性样品的连续注入，会引起固定相对样品的吸附、缔合等不良效应，使柱效降低，峰形展宽或拖尾等现象。为此，在每一次分离工作完成时，必须对色谱柱进行再生处理。正相色谱柱可用甲醇-氯仿（1∶1）流动相进行再生；反相色谱柱可用甲醇流动相再生处理。

4.化学键合相的极性分类

（1）非极性键合相

非极性键合相的表面基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基（可诱导极化）等。例如十八烷基键合相是目前反相色谱法最常用的非极性键合相，它是将十八烷基硅氯烷试剂与硅胶表面的硅羟基，经过缩合反应而成的键合相。非极性固定相的分离对象是非极性至弱极性类化合物，以甲醇-水、乙腈-水为流动相。

（2）中等极性键合相

它主要是指醚基键合相（如YWG-ROR′）。这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的相对极性大小而定。中等极性键合相的分离对是弱极性至中等极性类化合物，流动相的组成和配比依据分离对象及固定相极性大小而定。

（3）极性键合相

常用极性键合相为氨基键合相（强极性）、氰基键合相（中强极性），是分别将氨丙硅烷基及氰基键合在硅胶表面的硅醇基上而成。它们用于正相色谱法的固定相，其分离对象是中等极性-极性类的化合物，以正己烷加适当极性调整剂为流动相。