从动物组织提取基因组DNA-分子微生物学实验指导

1.实验材料

哺乳动物新鲜组织。

2.实验设备

移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。

3.实验试剂

（1）分离缓冲液 10mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。

（2）其他试剂液氮，10% SDS，蛋白酶K（20mg/mL或粉剂），乙醚，苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE，RNase A（10μg/μL）。

4.操作步骤

（1）切取组织5g左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵（越细越好）。

（2）倒入液氮，磨成粉末，加10mL分离缓冲液。(www.xing528.com)

（3）加1mL 10% SDS，混匀，此时样品变得很黏稠。

（4）加50μL或1mg蛋白酶K，37℃保温1～2h，直到组织完全解体。

（5）加1mL 5mol/L NaCl，混匀，5000r/min离心数秒。

（6）取上清于新离心管，用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提。待分层后，3000r/min离心5min。

（7）取上层水相至干净离心管，加2倍体积乙醚抽提（在通风情况下操作）。

（8）移去上层乙醚，保留下层水相。

（9）加1/10体积3mol/L NaAc，及2倍体积无水乙醇，颠倒混合沉淀DNA。室温下静置10～20min，DNA沉淀形成白色絮状物。

（10）用玻璃棒钩出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗后，在吸水纸上吸干，溶解于1mL TE中，-20℃保存。

（11）如果DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000r/min短暂离心，取上清；如要除去其中的RNA，可加5μL RNaseA（10μg/μL），37℃保温30min，用苯酚抽提后，按步骤（9）～（10）重沉淀DNA。