1.实时荧光定量PCR原理
实时PCR（实时荧光定量PCR）就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一般来讲，实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件的工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等方式工作，独特的是微量荧光检测系统，它由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机；光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线、荧光阈值和Ct值。
一般来讲，第3～15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时的PCR循环次数，是一个没有单位的参数，Ct值跟初始模板的量成反比。
2.实时荧光定量PCR的种类
根据实时荧光定量PCR的化学发光原理可以分为两大类：一类为探针类，包括TaqMan探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBR Green I或者特殊设计的引物（如LUX引物），通过荧光染料来指示产物的增加。
（1）TaqMan探针法TaqMan探针是最早用于定量的方法，在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，5′端标记一个报告荧光基团，3′端标记一个猝灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收，也就是FRET反应；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离，荧光监测系统从而可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
（2）分子信标法一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的猝灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15～30个核苷酸，并与目标序列互补；茎一般为5～7个核苷酸，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而猝灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细地设计，以至于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与猝灭剂分开，荧光基团被激发，产生荧光信号。
（3）SYBR Green法SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧光染料，SYBR Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR Green染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
（4）LUX引物法LUX（light upon extention）引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3′端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光猝灭。在有目标片段的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
3.实时荧光定量PCR的实验设计
实验设计其实比实验本身更重要，好的实验设计可以事半功倍，节省时间。对于一个实时荧光定量PCR而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后是引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的一半。
（1）实验材料的处理和准备 以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组和处理组。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存。但这种方法携带不方便，尤其对于异地取材。现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液，比如百泰克的RNAfixer。
（2）引物设计
①一般实时荧光定量PCR引物的设计遵循下面一些原则：扩增产物长度在80～150bp；引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性；产物不能形成二级结构；引物长度一般在15～30bp之间；G+C含量在40%～60%之间；碱基要随机分布；引物自身不能有连续4个碱基的互补；引物5′端可以修饰，引物3′端不可修饰；引物3′端要避开密码子的第3位。
②Taqman探针的设计稍有不同，一般由公司设计合成。遵循下面一下原则：尽量靠在上游引物；长度30～45bp，Tm比引物至少高5℃；5′端不要是G，G会有猝灭作用，影响定量。
4.实时荧光定量PCR的操作过程(www.xing528.com)
（1）RNA提取和反转录 在抽提RNA的过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则。
①全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。应培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
②使用灭菌的一次性塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器，以防RNA酶交叉污染。
③在提取裂解液的过程中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150℃的烘箱中烘烤4h；塑料器皿可以在0.5mol/L NaOH中浸泡10min，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
（2）Mix配制一般来讲，实时荧光定量PCR Mix都是2倍的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于实时荧光定量PCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者S D太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为 100～400mmol/L；模板如果是总RNA，一般是10～500ng，如果是cDNA，通常情况下是 1μL或者1μL的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用Mix、模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配制过程中，有下面几点需要注意。
①Mix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4℃。
②每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一个枪头加样。
③所有成分加完后，离心去除气泡。
④每个样品至少设置3个平行孔。
思考题
1.PCR出现非特异性带，可能有哪些原因？
2.降落PCR为何可以增加PCR反应的特异性？
3.在实时荧光定量PCR中，SYBR Green法和TaqMan探针法的区别是什么？
4.实时荧光定量PCR在引物设计方面与常规PCR有什么区别？
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