一、实验目的
二、实验原理
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品进行一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品（如活菌制剂）检测以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。但平板菌落计数法的步骤烦琐，而且测定值常受各种因素的影响。
三、实验仪器和材料
（1）菌种：大肠杆菌。
（3）其他用具：1 mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5 mL无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
四、实验步骤
1.编号
取无菌平皿9个，每3个为一组；3组分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6（稀释度）。另取6支盛有4.5 mL无菌水的试管，依次标10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2.稀释
用1 mL无菌吸管吸取1 mL已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5 mL至标10-1的试管中，此即为10倍稀释，得到10-1稀释度的菌液。将多余的菌液放回原菌液中。将标10-1的试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支1 mL吸管插入标10-1的试管中来回吹吸菌悬液3次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛、太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10倍稀释的菌液1 mL，精确地放0.5 mL至标10-2的试管中，此即为100倍稀释，得到10-2稀释度的菌液。其余依次类推。
放菌液时吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。
3.倒平板法
（1）取样。用3支1 mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6稀释度的菌悬液各1 mL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2 mL。
注意：不要用1 mL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2 mL稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平皿间的操作误差。
（2）倒平板。尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入熔化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
注意：由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。(www.xing528.com)
（3）待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养基中培养。
4.涂布法
涂抹平板计数法与倒平板法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平皿中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1 mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号共3个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀。每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在按先低浓度后高浓度的顺序涂抹时，可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20～30 min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，37℃保温培养，至长出菌落后计数。
5.计数
培养48 h后，取出培养平板，算出同一稀释度3个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：
每毫升中菌落形成单位（CFU）=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
一般选择每个平板上长有30～300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适，同一稀释度的3个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复3个，对照平板不能少于3个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5和10-6 3个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
平板菌落计数法中，所选择的用于计数的稀释度很重要，一般选择每个平板上长有30～300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数。一般3个连续稀释度中的第2个稀释度倒平板培养后，所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。
五、实验结果
将培养后菌落计数结果填入表1-6。
表1-6 菌落计数表
六、思考题
（1）为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？
（2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
（3）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
（4）当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？
（5）用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48 h）后观察结果？
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