一、实验目的
(1)了解土壤微生物DNA提取的原理和方法。
(2)掌握PCR反应的原理、实验操作和DNA检测技术。
(3)学习用PCR技术检测土壤中细菌、真菌和放线菌等微生物。
二、实验原理
传统的微生物检测方法局限于环境中极少部分(0.1%~1%)可培养的种类。PCR可以简便、灵敏、快速、特异性地检测微生物,目前已广泛用于土壤、水体、大气等环境监测领域。PCR检测大致需4个步骤:提取DNA、选择靶标基因、PCR扩增DNA、DNA检测。
1.提取土壤微生物DNA
土壤微生物DNA的提取包括细胞破壁、核酸抽提、核酸沉淀和核酸纯化。若土壤样品中腐殖酸含量较高(腐殖酸会干扰PCR扩增),还需用交联聚乙烯吡咯酮(PVPP)纯化柱纯化DNA提取液。
2.选择合适的靶标基因
本实验选择微生物核糖体小亚基基因(即原核微生物的16S r RNA和真核微生物的18S r RNA)作为靶标基基因。这些基因包含若干可变区和保守区,保守区与可变区连续交替分布。不同种类微生物的可变区序列不同。根据保守区序列合成PCR引物可扩增核糖体小亚基基因的可变区段,用于区分不同种类微生物。本研究选取338F/518R、NS1/ns2+10和234F/518R这3对引物来分别扩增细菌、真菌和放线菌的核糖体小亚基基因。
三、实验器材
1.土壤样品
实验样品为农田土壤和林地土壤。
2.PCR扩增引物
用于扩增细菌、放线菌和真菌核糖体小亚基基因的引物和扩增产物片段大小见表3-5。
表3-5 PCR扩增引物及其序列
3.阳性对照菌株
实验所用阳性对照菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。
4.培养基
实验所用培养基有牛肉膏蛋白胨液体培养基、高氏1号液体培养基、马丁氏液体培养基。
上述3种培养基配方见附录三。
5.试剂
实验所用试剂列举如下。
(1)土壤微生物DNA提取试剂盒:Fast DNA®Spin kit for soil。
(2)细菌、真菌DNA提取试剂盒。
(3)核酸提取缓冲液(0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液和1%SDS):称取42.98 g十二水磷酸氢二钠和10.0 g十二烷基硫酸钠(SDS)溶于800 mL无菌去离子水中,并定容至1 L。
(4)氯仿-异戊醇混合液(24∶1):量取分析纯氯仿120 mL和分析纯异戊醇5 mL混合。
(5)酚-氯仿-异戊醇混合液(25∶24∶1):量取分析纯酚50 mL和氯仿-异戊醇混合液(24∶1)溶液50 mL混合。
(6)乙酸钠(3 mol/L):称取分析纯乙酸钠24.609 g溶于80 mL无菌去离子水中,并定溶至100 mL。
(7)异丙醇:分析纯。
(8)乙醇(70%):量取350 mL无水乙醇加入到150 mL无菌去离子水中。
(9)TE缓冲液:量取5 mL 1.0 mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)和1 mL 0.5 mol/L EDTA溶液(pH 8.0)400 mL至无菌去离子水中,定容至500 mL,121℃高温灭菌20 min。
(10)PCR缓冲液(10×)、脱氧核苷三磷酸(d NTP,各2.5 mmol/L)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、Mg2+(25 mmol/L)。
(11)Goldview DNA染料。
(12)DNA Marker:100 bp DNA Ladder和λHindⅢMarker。
(13)DNA上样缓冲液(6×)。
(14)TAE缓冲液(50×):称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)242 g、Na2 EDTA·2H 2 O 37.2 g于1 L烧杯中,加入约800 mL去离子水并搅拌均匀;再加入57.1 mL的冰乙酸,充分溶解;用1 mol/L NaOH调pH至8.3;加去离子水定容到1 L,室温保存。使用时,稀释100倍。(www.xing528.com)
(15)琼脂糖凝胶(0.8%,W/V):称取分生物级琼脂糖0.8 g加入到100 mL 0.5×TAE缓冲液中,加热溶解,室温保存。
(16)琼脂糖凝胶(1.5%,W/V):称取分生物级琼脂糖1.5 g加入到100 mL 0.5×TAE缓冲液中,加热溶解,室温保存。
6.仪器和其他用具
实验所用仪器和其他用具有PCR仪(热循环仪,如Bio-rad C1000)、核酸提取仪、高速离心机、电泳仪、水平电泳槽及制胶器、凝胶成像系统、具螺旋盖2 mL离心管、PCR管(0.2 mL)、直径0.5 mm的玻璃珠、移液器等。
四、实验步骤
(一)DNA的提取和检测
1.手提法提取土壤DNA
(1)细胞破壁。在无菌的具螺旋盖2 mL离心管中加入0.5 g土壤样品、1.0 mL核酸提取缓冲液和0.5 g直径0.5 mm的灭菌玻璃珠,旋紧管盖,置于核酸裂解仪,5.5 m/s振荡40 s后,以14 000 r/min的转速离心10 min。
(2)DNA抽提。将上清液转移至2 mL离心管中并加入等体积酚-氯仿-异戊醇混合液(25∶24∶1),抽提1次,14 000 r离心5 min。将上清液转移至离心管并加入等体积氯仿-异戊醇混合液(24∶1)抽提1次,以14 000 r/min的转速离心5 min。
(3)DNA沉淀:将上清液转移至2 mL离心管中并加入适量3 mol/L乙酸钠(使其终浓度达到0.3 mol/L)和等体积异丙醇,于-20℃放置2 h以上,使DNA沉淀,之后以14 000 r/min的转速离心5 min。
(4)DNA纯化。弃去上清液,加入预冷的70%乙醇洗涤沉淀,14 000 r离心5 min。弃去上清液。空干后,加入30~50μL TE缓冲液充分溶解DNA,置于-20℃环境中保存。
2.试剂盒法提取土壤微生物DNA
实验采用Fast DNA®Spin kit for soil土壤微生物DNA提取试剂盒,提取步骤参见说明书。
3.细菌、真菌和放线菌阳性对照模板DNA的提取
挑取大肠杆菌、产黄青霉和灰色链霉菌单菌落分别接种至牛肉膏蛋白胨固体培养基、马丁氏固体培养基和高氏1号固体培养基平板,经过一段时间培养,获得大肠杆菌、产黄青霉和灰色链霉菌的纯培养。采用手提法或试剂盒法提取大肠杆菌、产黄青霉和灰色链霉菌DNA,分别作为细菌、真菌和放线菌PCR检测的阳性对照模板DNA。其中,大肠杆菌菌悬液可直接代替大肠杆菌DNA作为细菌阳性对照模板。
4.DNA的检测
加热熔解0.8%琼脂糖凝胶,待降温到55℃左右,倒入制胶器中,并插入制胶梳。待琼脂糖凝胶冷却成型,取2.5μL DNA提取液及0.5μL 6×DNA上样缓冲液混合后,于0.5×TAE缓冲液中电泳检测,以λHindⅢMarker作为标准。电泳仪设定电压100 V,电泳30 min。电泳完毕,用Goldview DNA染色20 min。在紫外灯下检查电泳结果,并用凝胶成像系统摄像对图像进行分析。
(二)PCR扩增靶标基因
1.PCR体系
按表3-6将各组分依次加到无菌的0.2 mL PCR管底部,混匀。除设置阳性对照外,还须用无菌超纯水来取代模板DNA作为阴性对照。
2.PCR操作步骤
细菌、真菌和放线菌的PCR操作步骤按表3-7进行。扩增完成后,PCR产物4℃保存。
3.PCR产物的检测
加热熔解1.5%琼脂糖凝胶,待降温至55℃左右,倒入制胶器中,并插入制胶梳。等琼脂糖凝胶冷却成型,取5μL PCR产物及1μL 6×DNA Loading Buffer混合后,于0.5×TAE缓冲液中电泳检测,以100bp DNA Ladder作为Maker。电泳仪设定电压100 V,电泳30 min。电泳完毕,用Goldview DNA染色20 min,在紫外灯下检查电泳结果,并用凝胶成像系统摄像并对图像进行分析。
表3-6 PCR体系各组分表
表3-7 PCR操作步骤
五、实验数据记录、分析、处理
在图3-2中绘制所提取的土壤微生物DNA和PCR产物的凝胶电泳成像图谱,并标注图谱中DNA片段(包括Marker)的大小。
图3-2 土壤微生物DNA(A)和PCR产物(B)凝胶电泳成像力的模拟图
M1:λHindⅢMarker;M2:100 bp DNA Ladder;A1:农田土壤DNA;A2:林地土壤DNA;B1:细菌PCR产物;B2:真菌PCR产物;B3:放线菌PCR产物
六、思考题
(1)手提法和试剂盒提取土壤DNA的效果是否相同?请分析原因。
(2)若PCR扩增产物条带微弱、弥散或无条带,请分析原因。用什么方法可以提高扩增效率?
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