环境化学实验：叶绿素a测定的分光光度法

一、实验原理

富营养化水体所受到的污染，尤以氮磷为甚，致使其中的藻类等浮游植物旺盛生长。浮游植物的主要光合色素是叶绿素，常见的有叶绿素a、叶绿素b和叶绿素c。叶绿素a存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1%～2%，是估算浮游植物生物量的重要指标。通过测定浮游植物叶绿素，可初步掌握水体质量，在水质监测中，可将叶绿素a作为湖泊富营养化的指标之一。

浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法（HPLC法）、荧光光度计法和分光光度计法等。分光光度计法中，根据所用的色素萃取液分为了丙酮法、甲醇法和乙醇法等，再根据比色所用的波长，又分为单色法和多色法（例如单色丙酮法和四色丙酮法）等。

本实验采用丙酮萃取分光光度法测定叶绿素a含量。将一定量的试样用微孔滤膜过滤，收集植物性浮游生物，用90%的丙酮溶液提取。将提取液离心分离后，测定750、663、645和630 nm的吸光度，计算叶绿素的浓度。

二、实验试剂与仪器

1.试剂

（1）MgCO3悬液：lg MgCO3细粉置于烧杯中，加入100 mL蒸馏水中，搅拌均匀。

（2）90%的丙酮溶液：90份丙酮加10份蒸馏水。

2.仪器

（1）分光光度计。

（2）比色杯，1 cm，4 cm。

（3）台式离心机（3 500 r/min）。

（4）离心管，15 mL。

（5）小研钵。

（6）蔡氏滤器，滤膜（0.45 μg，直径47 mm）。

（7）真空泵（最大压力不超过300 kPa）。

三、实验步骤

1.采集水样

用5 L有机玻璃采水器采集，取上层（离水面0.5 m），中层（0.5 H，H为采样时实测水深），下层（离湖床0.5 m）三层水样等体积混合，取1L装入广口塑料瓶，湖泊、水库采样500 mL，池塘300 mL。(https://www.xing528.com)

2.过滤水样

在蔡氏滤器上装好滤膜，取水样50～500 mL减压过滤，抽滤的压力不大于150 mmHg。为了增进藻细胞滞留在滤膜上，防止提取过程中叶绿素a分解，待水样剩余若干毫升之前加入0.2 mL MgCO3悬液、摇匀直至抽干水样。

3.提取

将滤膜放于小研钵内，加2～3 mL 90% 丙酮溶液，研磨匀浆，以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管中，用5 mL 90% 丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加90% 丙酮，使管内总体积为10 mL。塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取18～24 h。

4.离心

提取完毕，置离心管于台式离心机上3 500 r/min，离心10 min，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞上塞子，经3 500 r/min再离心10 min。正确记录提取液的体积。

5.测定光密度

藻类叶绿素a具有其独特的吸收光谱（663 nm），因此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取液移入1 cm比色杯中，以90% 的丙酮溶液作为空白，分别在750、663、645、630 nm波长下测提取液的光密度值（OD）。注意：样品提取的OD663值要求在0.2与1.0之间，如不在此范围内，应调换比色杯，或改变过滤水样量。OD663小于0.2时，应该用较宽的比色杯或增加水样量；OD663大于1.0时，可稀释提取液或减少水样滤过量，使用1 cm比色杯比色。

四、数据处理

叶绿素a浓度计算：将样品提取液在663、645、630 nm波长下的光密度值（OD663、OD645、OD630）分别减去在750 nm下的光密度值（OD750），此值为非选择性本底物光吸收校正值。叶绿素a浓度计算公式如下：

式中：ca——叶绿素a的浓度，mg/L；

V1——提取液的定容体积，mL；

V2——过滤水的体积，mL；

L——比色池的光程长度，mm。

思考题

1.水体富营养化的危害是什么？

2.简述水体富营养化的机制。

3.用哪些指标表征一个天然水体富营养化程度更合理？